Термотаблетка убл: Термотаблетка убл – Лучшая цена!!! Купить устройство блокировки люка (УБЛ) для стиральной машины Indesit (Индезит)/Ariston (Аристон)

Мы картировали интерфейс между midasin и WDR12 и подтвердили, что консервативный глутамат, остаток Glu ⁷⁸ WDR12 (Glu ⁸⁰ в S. cerevisiae Ytm1) , требуется для связывания мидасина. Мутация либо консервативных остатков аспарагиновой кислоты в консенсусном мотиве MIDAS, либо консервативного глутамата в доменах UBL Ytm1 и Rsa4 устраняет взаимодействия между мидазином и Ytm1 / Rsa4 у дрожжей (21, 24).Чтобы определить, верно ли это и для клеток млекопитающих, мы мутировали соответствующий глутамат в WDR12 (Glu ⁷⁸ ) на аланин и обнаружили, что мутация E78A не способна связывать домен MIDAS мидазина ( A ). Было показано, что мутация S78L в дрожжевом Ytm1 является синтетической летальной в сочетании с мутантом Rea1 (21). Этот остаток серина консервативен в WDR12 млекопитающих ( B ), и мутация Ser ⁷⁶ в лейцин значительно снижает связывание с доменом MIDAS мидазина ( A ).Однако мутация Ser ⁷⁶ на остаток глутамата не влияла на связывание с мидазином ( A ). Выравнивание последовательностей WDR12 у многих видов ( B ) показало, что высшие организмы имеют небольшую вставку в петлю, следующую за первой α-спиралью, а делеция остатков 47-50 WDR12 млекопитающих также значительно снижает связывание с доменом MIDAS мидазина ( А ). Мы также мутировали консервативные остатки аспарагиновой кислоты в рамках консенсусного мотива MIDAS в мидазине, но не смогли определить, отменяют ли они связывание WDR12, потому что мы не смогли обнаружить экспрессию мутанта двойной аспарагиновой кислоты midasin-MIDAS при трансфекции в клетки HEK293.

Ион металла необходим для связывания WDR12 и мидазина. A , Вестерн-блоттинг анализ GST с мутациями UBL WDR12. B , модель взаимодействия мидазина ( синий, ) и UBL-доменом WDR12 ( фиолетовый, ). Модель гомологии мидазина была создана на основе кристаллической структуры интегрина αLβ2 (запись в банке данных белков 1T0P). Остатки, важные для координации иона металла ( красный, ), показаны в виде стержней .C , GST-версии midasin и WDR12 с ЭДТА и без нее. Клетки лизировали в присутствии или в отсутствие EDTA, и связывание анализировали с помощью GST-анализа с последующим анализом SDS-PAGE (Simply Blue Stain (Thermo)). WCL , лизат цельных клеток.

Ион металла необходим для связывания мидазина-MIDAS и WDR12

После проверки того, что остатки, которые считаются важными для координации иона металла между мидазином и WDR12, важны для связывания, мы продемонстрировали, что образование комплекса зависит от присутствия ион металла.Домены MIDAS широко изучены в интегринах, где они играют важную роль в обеспечении связывания лиганда через координацию иона металла, который необходим для связывания лиганда (22, 37, 38). Мы создали модель гомологии для взаимодействия домена UBL WDR12 и домена MIDAS мидазина с использованием нашей структуры UBL Ytm1 для WDR12 и интегрина αLβ2 (запись в банке данных белков 1T0P) структуры домена MIDAS для мидазина ( B ).

В кристаллической структуре интегрина αLβ2, связанного с его лигандом ICAM, металл, связанный между двумя белками, представляет собой ион магния.Домен MIDAS мидазина содержит полную каноническую консенсусную последовательность MIDAS (hhhhD X S X S, ∼70 остатков T и hhhh (S / T) DG в ∼30 остатках, где h – любой гидрофобный остаток и X – любой остаток ( A )), как обнаруживается в интегрине αLβ2 (39). WDR12 и Nle1 также содержат консервативный остаток глутаминовой кислоты, такой как лиганд ICAM. Таким образом, все шесть остатков, которые координируют ион металла, сохраняются, поэтому мы полагаем, что координация иона металла будет такой же, как у интегрина αLβ2, связанного со своим лигандом ICAM.В нашей модели гомологии отсутствует область расширения MIDAS, потому что у нас нет структурной информации для этой области. Чтобы определить важность иона металла для связывания WDR12 с доменом мидазина MIDAS, мы трансфицировали клетки HEK293 плазмидами, содержащими мидазин MIDAS человека и WDR12 человека. Через 72 часа после трансфекции клетки собирали, разделяли пополам, а затем лизировали в присутствии или в отсутствие 10 мМ ЭДТА для устранения координации металлов. EDTA значительно снижает количество WDR12, которое может быть удалено с помощью GST-тегированного midasin-MIDAS ( C ).Этот результат подтверждает, что ион металла необходим для содействия образованию комплекса между доменом MIDAS мидазина и WDR12.

WDR12, но не мидазин локализуется в ядрышке в клетках U2OS

Чтобы дополнительно охарактеризовать WDR12 и мидазин млекопитающих, мы провели эксперименты по иммунофлуоресценции на клетках остеоскаркомы U2OS со специфическими антителами к WDR12 и мидазину. Эндогенный WDR12 обнаруживает заметную ядрышковую локализацию, как и ожидалось (15), тогда как эндогенный мидазин локализуется как в нуклеоплазме, так и в цитоплазме ().Интересно, что мидазин, по-видимому, также имеет заметную локализацию в определенном месте в цитоплазме, указывая тем самым, что он может выполнять дополнительные нерибосомные роли в клетке (). Локализация эндогенного WDR12 в ядрышке согласуется с его ролью на ранних стадиях биогенеза рибосом, которые происходят в ядрышке, тогда как локализация мидазина в нуклеоплазме согласуется с его ролью на более поздних стадиях биогенеза рибосом ( 40).

WDR12 требует транскрипции РНК-полимеразы I. для локализации ядрышка.Клетки U2OS фиксировали и иммуноокрашивали антителом против WDR12 ( красный, ) или антителом против мидазина ( красный, ), и ДНК визуализировали путем окрашивания DAPI ( синий, ). Клетки обрабатывали ДМСО или актиномицином D в течение 2 ч до фиксации. Масштабная линейка представляет все панели .

Затем мы хотели определить, влияет ли локализация WDR12 и мидазина клеточным стрессом и транскрипцией рРНК. Нарушение транскрипции рРНК различными клеточными стрессорами может вызвать релокализацию белков, участвующих в биогенезе рибосом (41).Например, Pes1, один из других белков, связанных с WDR12 в комплексе PeBoW, перемещается из ядрышка в нуклеоплазму при индукции клеточного стресса (42). Чтобы имитировать клеточный стресс, мы обрабатывали клетки U2OS низкой концентрацией (10 мкМ) актиномицина D для ингибирования транскрипции рРНК РНК-полимеразой I, и мы повторили наши эксперименты по иммунофлуоресценции с использованием ДМСО в качестве контроля. WDR12 теряет свою ядрышковую локализацию при обработке актиномицином D, но не только ДМСО. Вместо этого он обнаруживается в нуклеоплазме, подтверждая, что клеточный стресс влияет на локализацию WDR12 ().Напротив, нуклеоплазматическая локализация мидазина не изменилась при обработке клеток актиномицином D или ДМСО ().

Обсуждение

Для сборки эукариотических рибосом необходимы два важных белка, Ytm1 / WDR12 и Rsa4 / Nle1, которые несут в себе домены UBL, за которыми следуют С-концевые домены β-пропеллера WD40. С помощью рентгеновской кристаллографии мы определили кристаллическую структуру домена UBL дрожжевого гомолога Ytm1 / WDR12. Домены UBL имитируют свойства убиквитина за счет включения убиквитиновой β-захватывающей складки в свои белковые кодирующие области.Они используются в самых разных клеточных процессах, таких как деградация белка, репарация ДНК, деление клеток и аутофагия, и часто являются частью мотивов белок-белкового взаимодействия (34, 43, 44). WDR12 и Nle1 – единственные известные белки, содержащие домен UBL в пути сборки рибосомы. Функция этого домена состоит в том, чтобы рекрутировать хвост большого моторного белка midasin и управлять высвобождением как комплекса PeBoW, так и Nle1 из прерибосомных частиц, предположительно посредством механизмов фактор-реле, которые вызывают изменения конформации в пре-рРНК (33).Недавняя кристаллическая структура дрожжевого гомолога Rsa4 / Nle1 содержала две копии белка в асимметричной единице, и, что интересно, домен UBL в каждом имел различную ориентацию по отношению к β-пропеллеру, что позволяет предположить, что вращательная гибкость домена UBL может иметь значение для функции (33). Во время пересмотра этой рукописи другая группа опубликовала кристаллическую структуру Chaetomium thermophilium Ytm1, связанного с С-концевым концом Erb1. Как наблюдалось для Rsa4, они также обнаружили, что домен UBL Ytm1 обнаруживается в различных ориентациях, подчеркивая гибкую ориентацию этого домена по отношению к домену β-пропеллера (45).Учитывая структурное сходство домена UBL Ytm1 / WDR12, представленного здесь, и Rsa4 / Nle1 ( A ), включая перекрывающиеся остатки глутамата, взаимодействия между доменом MIDAS мидазина и доменами UBL WDR12 и Nle1 должны быть очень похожими. Это напоминает интегрины, которые могут взаимодействовать с рядом различных лигандов через свои домены MIDAS (46).

В то время как WDR12 и Nle1 хорошо законсервированы, мало что известно об их роли в биогенезе рибосом млекопитающих.В этом исследовании мы представляем первые доказательства того, что взаимодействия с мидазином и WDR12, а также с мидазином и Nle1 законсервированы у высших организмов. Как и в дрожжах, домен UBL WDR12 необходим для связывания мидазина, но не для образования комплекса PeBoW вместе с Pes1 и Bop1 ( C ). UBL-домен Nle1 также необходим для связывания мидазина ( D ). Эти результаты подтверждают, что высвобождение ядрышкового комплекса PeBoW и нуклеоплазматического Nle1 с помощью большого моторного белка, midasin, является хорошо законсервированной стадией в пути созревания эукариотических рибосом.

Роль WDR12 и мидазина в биогенезе рибосом млекопитающих также подтверждается их эндогенной локализацией. WDR12 демонстрирует заметную локализацию ядрышка; однако клеточный стресс, вызванный обработкой клеток актиномицином D, останавливает транскрипцию рРНК и приводит к перемещению WDR12 в нуклеоплазму (2). Мидазин человека не обнаруживал ядрышковой локализации, а скорее обнаруживался в нуклеоплазме и цитоплазме как в нормальных, так и в стрессовых условиях (). Локализация человеческого мидазина аналогична локализации его дрожжевого гомолога, который не обнаруживается в ядрышке, за исключением присутствия глутаматного мутанта E80A Ytm1, который останавливает созревание рибосом (21).Как мидазин рекрутируется на прерибосомные частицы в ядрышке, пока неизвестно. Предыдущая работа предположила, что WDR12 и комплекс Rix являются двумя наиболее вероятными кандидатами для рекрутирования, хотя могут быть задействованы и другие транс-действующие факторы (21). В совокупности эти результаты подтверждают, что мидазин только временно связан с ядрышком, чтобы управлять высвобождением комплекса PeBoW.

Мы также определили, что область удлинения MIDAS в мидазине млекопитающих необходима для связывания WDR12 и Nle1 ().Область удлинения не является частью канонического домена MIDAS, но является высококонсервативной и важной для связывания WDR12 и Nle1, предполагая, что она также может играть важную роль в координации ионов металлов. Функции интегринов зависят от ионов металлов, и их зависимость от ионов металлов хорошо изучена (38). Некоторые интегриновые домены содержат сайты связывания ионов металлов в дополнение к домену MIDAS. Например, домен интегрина βI состоит из трех взаимосвязанных сайтов связывания ионов металлов, включая сайт MIDAS, примыкающий к сайту MIDAS (AMIDAS), и синергетический сайт связывания ионов металла (SyMBS).Точное значение in vivo и ролей всех трех сайтов неясно, но in vitro , все три сайта, по-видимому, играют важную роль в опосредовании связывания лиганда (38). Нет никакого сходства последовательностей между областью удлинения MIDAS и сайтами связывания ионов металлов SyMBS или AMIDAS, но область удлинения MIDAS может представлять новый тип координационного сайта иона металла. Биоинформатический анализ показал, что существует слабое сходство между областью удлинения MIDAS и субъединицей D хелатаз магния, основанное на высокой плотности основных и гидрофобных остатков непосредственно перед доменом MIDAS (23).Хелатазы магния, которые играют важную роль в биосинтезе хлорофилла, вставляя Mg ²⁺ в протопорфирин, также содержат C-концевые домены MIDAS и два N-концевых домена AAA (47). Помимо хелатаз магния и мидазина, существует только один известный белок, VWA8 (обнаружен только у высших организмов; функция неизвестна), который содержит комбинацию доменов AAA и MIDAS (37). Дальнейшая работа будет необходима для определения точной роли области удлинения MIDAS в midasin, но будет интересно посмотреть, существует ли функциональная связь между доменами AAA и доменом MIDAS, потому что эта комбинация также встречается в двух др. Белках.

В этой статье мы представляем первую структуру с высоким разрешением UBL домена дрожжевого гомолога Ytm1 / WDR12 и демонстрируем, что мидазин млекопитающих связывается как с WDR12, так и с Nle1, двумя белками, которые имеют интересные последствия для здоровья человека. Недавняя работа продемонстрировала, что сверхэкспрессия WDR12 вызвана сердечной перегрузкой, а исследования ассоциации генома связывают ген WDR12 с ранним началом инфаркта миокарда и ишемической болезни сердца (20, 48).Также было показано, что повышающая регуляция WDR12 приводит к активации пути p38 MAPK, увеличению уровней Bop1 и, в конечном итоге, к дисфункции миокарда, что позволяет предположить, что WDR12 может быть новой терапевтической мишенью для пациентов с сердечной недостаточностью (20). Более того, повышенные уровни белков, связанных с комплексом PeBoW, были обнаружены при многих различных типах рака человека, включая нейробластому, гепатоцеллюлярную карциному и рак груди, толстой кишки и яичников (42, 49, –55). Nle1 также недавно было показано, как критический фактор для гомеостаза кишечника и потребность в органогенезе, особенно в формировании осевого скелета у мышей (13, 56).Дальнейшие исследования роли WDR12 и Nle1 необходимы для определения механизмов, с помощью которых они участвуют в сердечной функции и гомеостазе кишечника, но наша работа показывает, что взаимодействия между доменами UBL WDR12 и Nle1 с мидазином являются важными эволюционно законсервированными взаимодействиями. для синтеза эукариотических рибосом.

Вклад авторов

E. M. R. очистил и кристаллизовал UBL-домен Ytm1 и определил его структуру.E. M. R. спроектировал и сконструировал векторы для «pull-down» и охарактеризовал сложное взаимодействие в клетках млекопитающих. M.S. провел эксперименты по иммунофлуоресценции и весь вестерн-блот-анализ. Р. Э. С. разработал исследование и задумал эксперименты. E. M. R., M. S. и R. E. S. проанализировали данные, подготовили цифры и написали статью.

Благодарности

Мы благодарим Трэйси М. Танака Холл и Майкла Дж. Рагуза за критическое прочтение рукописи. Мы также благодарим NIEHS, Национальные институты здравоохранения, Protein Expression Core за помощь с культурой клеток млекопитающих и ядро ​​рентгеновской кристаллографии NIEHS за помощь в сборе данных.Дифракционные данные были собраны Юго-восточной региональной группой совместного доступа (SER-CAT) 22-ID и 22-BM пучков пучков в усовершенствованном источнике фотонов, Аргоннская национальная лаборатория. Мы также благодарим Центр флуоресцентной микроскопии и визуализации NIEHS за помощь в проведении иммунофлуоресцентных экспериментов.

^* Эта работа была полностью или частично поддержана Программой внутренних исследований NIEHS, Национальных институтов здравоохранения. Использование усовершенствованного источника фотонов было поддержано Министерством энергетики США, Управлением науки, Управлением фундаментальных энергетических наук по контракту W-31-109-Eng-38.Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов по поводу содержания этой статьи. Авторы несут полную ответственность за содержание, которое не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.

Координаты атомов и структурные факторы (код 5DTC) депонированы в банке данных белков (http://wwpdb.org/).

² Используемые сокращения:

рРНК

рибосомальная РНК

MIDAS

металл-ион-зависимый сайт адгезии

AMIDAS

рядом с MIDAS

SyMBS

синергетический сайт связывания с ионами металла

молекула межклеточной адгезии.

Список литературы

(PDF) Тандемная аффинная очистка белков, конъюгированных с убиквитиноподобными фрагментами

p

uo

r

G

gn

i

h

s

i

фунтов

uP eru

t

a

N

010

2

© natureprotocols

/

m

e

r

u

t

a

n

.

w

w

w

/

/

:

pt

t

h

ПРОТОКОЛ

ПРИРОДА ПРОТОКОЛОВ | ТОМ 5 №5 | 2010 | 877

показывает, что с точки зрения общей численности (а не количества отдельных белков

), примеси составляют лишь около 15% от общего количества очищенного образца

.

Выбор культур клеток. Те, кто интересуется протеомом субстрата

Ubl, могут просто следовать протоколу, описанному здесь

, для ~ 100-200 чашек для культивирования клеток диаметром 15 см для своих клеток

TAP-Ubl и анализировать результаты с помощью МС. Однако, поскольку

не каждый идентифицированный белок будет истинным субстратом, это создает

проблему фильтрации реальных целевых белков от «очищенных примесей».Для сравнительного количественного анализа белков

доступен ряд методов, включая iTRAQ (Applied

Biosystems, Foster City, CA, USA) и методы без меток3 9,

, но это метод метаболического мечения, известный как SILAC ( см.

Вставка 2), который чаще всего используется в поле Ubl. Путем количественного сравнения набора контрольных данных, такого как очистка только TAP,

с тестовым набором (TAP-Ubl), можно сделать обоснованное суждение

о том, какой из сотен идентифицированных белков наиболее вероятен. до

могут быть конъюгатами Ubl на основании разницы в содержании конкретных белков

(см. Golebiowski et al.15 для примера) 30.

Мониторинг очистки. Может быть информативным сбор небольших

образцов элюентов и смол на разных этапах очистки,

, например, на этапах 7, 12, 14, 18, 20, 29 и 39. Это позволяет оценить эффективность

конкретные шаги с помощью окрашивания серебром или вестерн-блоттинга.

Сроки. Для получения образца очищенного белка, готового к анализу

из культивируемых клеток, требуется около 5–6 дней.Однако обычно требуется 6–8 дней для культивирования клеток перед экстракцией и очисткой белка и

фиксации, и 1-2 дня для экстракции пептидов из полиакриламидных гелей, готовых

для анализа МС. Помимо сбора данных МС, последующая обработка

может занять гораздо больше времени, чем подготовка образца (см. Вставку 1).

МАТЕРИАЛЫ

РЕАГЕНТЫ

Материалы, относящиеся к культуре клеток:

Клетки HeLa / TAP, HeLa / TAP-SUMO-2 или -1 (лаборатория RT Hay)

Среда Игла, модифицированная Дульбекко (Gibco, cat.нет. 61965)

Трипсин ЭДТА (Gibco, каталожный номер 25300)

Фетальная бычья сыворотка (Biosera, каталожный номер S1830-500)

Антибиотики по желанию (например, пенициллин и стрептомицин)

Для материалов, относящихся к SILAC культура клеток и маркировка см. ссылки 15,30,32

и вставку 2.

IAA (Sigma, каталожный номер I-6125)! ВНИМАНИЕ! ИУК токсичен; следовательно, избегайте прямого воздействия

.

β-меркаптоэтанол (Sigma, каталожный номер M-7154)! ВНИМАНИЕ! Β-меркаптоэтанол

токсичен; следовательно, избегайте прямого воздействия.

NP-40 (Calbiochem, каталожный номер 4)

SDS (Мелфорд, каталожный номер B2008)

Имидазол (Sigma, каталожный номер I-0125)

ЭДТА (Sigma, каталожный номер. E-5134)

EGTA (Fluka, каталожный номер 03777)

Трис-основание (Sigma, каталожный номер T-6066)

Полный ингибитор протеазы без ЭДТА (Roche, каталожный номер 11873580001)

Глицерин (BDH, кат. № 101186M)

Бромфеноловый синий (BDH, кат. № 443053A)

DTT (Formedium, кат. № DTT010)

Хлорид натрия (Sigma, кат.нет. S-7653)

Ацетат магния (Sigma, кат. № M-2545)

Хлорид кальция (Fisher Scienti ‑ fc, кат. № C / 1500/53)

Гидроксид натрия (VWR, кат. № 28244.295)

TCA (BDH, номер по каталогу 304894L)

Дезоксихолат (DOC; Calbiochem, номер по каталогу 264101)

Буфер для образца LDS (4 ×; Invitrogen, номер по каталогу B31010)

Восстановитель для образца LDS буфер (10 ×; Invitrogen, кат. номер NP0004)

Coomassie R-250 (BDH, кат. номер 443283M)

Буфер MOPS (Invitrogen, кат.нет. NP001)

IgG – сефароза 6 Fast Flow (GE Healthcare, кат. № 17-0969-01)

Кальмодулин – сефароза 4B (GE Healthcare, кат. № 17-0529-01)

TEV протеаза (~ 1 Ед / мкл; производится на месте; определение единицы / активность

установлено по сравнению с протеазой ProTEV, Promega, каталожный номер

V6051 – см. Описание производителя для подробностей)

ОБОРУДОВАНИЕ

Пипетка с плоским концом наконечники (Starlab, кат. № I1022-2600)

Наконечники с плоским концом сводят к минимуму потерю шариков на этапах аспирации надосадочной жидкости.

Скребки для клеток (TPP, кат. № 99003)

Настольная центрифуга (Heraeus Biofuge — Thermo Scienti c)

Сверхскоростная центрифуга (Beckman-Coulter, Avanti J-25 и ротор типа 70 Ti)

Жидкость Установка аспиратора (вакуумный газовый насос; VWR, кат. № PM 20405-86)

Пластиковые пробирки «Falcon» (15 и 50 мл; Greiner, кат. № 188271 и

210261, соответственно)

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

000 •

000 •

000 •

000 •

000 •

000 •

000

•

•

•

•

• 900 03

Пробирки с завинчивающейся крышкой (1.5 мл; Alphalabs, кат. нет. CP5515)

пробирки «Lo-Bind» (1,5 мл; Eppendorf, каталожный номер 022431081).  КРИТИЧНО Очень важно использовать пробирки с низкой способностью связывания с белками, чтобы избежать загрязнения образцов для конечной элюции белками

в промывочных буферах.

Соникатор с датчиком, подходящим для проб объемом ~ 30 мл (Branson digital

sonifer 450; Branson)

Гели и оборудование для PAGE.  КРИТИЧЕСКИЕ Могут использоваться в соответствии с предпочтениями пользователя

, но с использованием 10% (вес / объем) готовых гелей, таких как Invitrogen, кат.

нет. NP0301, предлагаются; в случае установки электрофореза от другого производителя

, следует использовать соответствующие рабочие буферы и буферы для образцов

вместо тех, которые указаны в этом протоколе.

Пластиковые одноразовые шприцы 5 и 10 мл

Иглы (~ 19 G)

Одноразовые фильтрующие блоки Minisart (0,2 и 0,45 мкм; Sartorius Stedim Biotech,

каталожные номера 16534 и 16555 соответственно)

Разное предметы, необходимые для установки системы очистки гравитационным потоком,

, такие как пластиковые одноразовые колонки, пробирки, краны, бутылки, штатив и т. д.Альтернативно

можно использовать собственную систему с помпой, такую ​​как быстрая жидкостная хроматография белков

, но мы считаем, что гравитационная система

собственной сборки является наиболее безопасным вариантом.

Гематологический роликовый миксер Stuart SRT-9 (Stuart Scienti)

Стерильные скальпели

НАБОР РЕАГЕНТОВ

Векторы pEFIRES-P, экспрессирующие TAP, TAP-SUMO-1 и TAP-SUMO-2

клетки со стабильной экспрессией белков HeLa этих белков и ограничений

карт доступны у нас по запросу.Для получения подробной информации о векторе pEFIRES-P

см. Рисунок 1a, b и Hobbs et al. 38.

Буфер для лизиса 50 мМ трис-HCl pH 8,0, 2% (вес / объем) SDS, 10 мМ IAA, 1 мМ

EDTA, полный ингибитор протеазы Roche (без EDTA). Приготовьте 150 мл путем смешивания

следующего: 7,5 мл 1 M трис / HCl pH 8,0, 15 мл 20% (вес / объем) SDS,

7,5 мл 200 мМ IAA, 300 мкл 500 мМ EDTA pH 8,0, Roche Complete Protease

Таблетки ингибитора, рекомендованные производителем (обычно три большие таблетки по

150 мл), вода до 150 мл.Хранить (без ингибиторов протеазы ИУК и Рош)

до месяца при комнатной температуре (КТ).  КРИТИЧЕСКАЯ ИУК для всех баффов

лучше всего готовить в виде 200 мМ раствора в воде и хранить при -20 ° C

в защищенном от света месте. Добавьте IAA и полный ингибитор протеазы непосредственно перед использованием

и храните при комнатной температуре. ! ВНИМАНИЕ! ИУК токсичен; избежать контакта.

Базовый буфер TAP (TBB) Состав 2 × раствора: 100 мМ Трис pH 8,0,

1.5 М NaCl. Этот буфер служит основным буфером для создания других буферов: буфер ренатурации

, буфер TEV, буфер для элюции кальмодулина и буфер связывания кальмодулина

. Приготовьте 2,3 л, смешав следующее: 230 мл 1 M Tris pH 8,0,

202 г NaCl, вода до 2,3 л. Хранить до месяца при 4 ° C.

Буфер для ренатурации (RB) 50 мМ Трис-HCl pH 8,0, 0,75 М NaCl, 1% NP-40,

2 мМ ИУК, 0,5 мМ ЭДТА. Приготовьте 4 мкл, смешав следующее: 2 мкл буфера TAP base

, 40 мл 100% NP-40, 40 мл, 200 мМ IAA, 4 мл 0.5 M EDTA, вода

до 4 л.  ВАЖНО Приготовить свежий и хранить при 4 ° C до тех пор, пока он не понадобится.

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

Характеристика протеазной активности Nsp3 при ингибировании SARS-CoVro-2 и его in vitro нанотела

Введение

COVID-19 нанес значительный урон человеческим жизням и беспрецедентным образом повлиял на общество.Следовательно, понимание механизмов, с помощью которых SARS-CoV-2 взаимодействует с клетками человека, и функций различных вирусных белков в установлении инфекции имеет первостепенное значение. Геном SARS-CoV-2 кодирует 16 неструктурных белков (Nsps), которые играют разные роли в жизненном цикле вируса (Wu et al , 2020). Nsp3, самый большой из Nsps, представляет собой мультидоменный мембранный белок 217 кДа, который является ключевым компонентом комплекса репликации и транскрипции вируса, собранного на мембранах клетки-хозяина, где происходит репликация и транскрипция вирусного генома (Angelini et al , 2013; Wolff et al , 2020a, 2020b).Другой важной ролью Nsp3 является его функция протеазы. Внутри Nsp3 кодируется папаин-подобная протеаза (PLpro ^CoV-2 ), которая расщепляет Nsp1-Nsp2, Nsp2-Nsp3 и Nsp3-Nsp4, высвобождая Nsp1, Nsp2 и Nsp3 из вирусного полипептида. В то время как несколько коронавирусов экспрессируют два фермента PLpro, SARS-CoV-2 экспрессирует только один фермент PLpro (Barretto et al , 2005).

PLpro ^CoV-2 имеет много общего с PLpro, закодированным с помощью SARS, PLpro ^SARS .Структура PLpro аналогична структуре деубиквитинирующих ферментов (DUB) человеческой убиквитинспецифической протеазы (USP), которые напоминают вытянутую или открытую руку с субдоменами большого пальца, ладони и пальцев, которые опосредуют контакты с субстратом с образованием сайта S1 (Shin et al. al , 2020; Klemm et al , 2020; Ratia et al , 2014; Chou et al , 2014). Помимо процессинга вирусных полипептидов, PLpro обладает деубиквитилирующей и деISGилирующей активностями, так как он также может эффективно расщеплять убиквитин и модификации ISG15 (Bailey-Elkin et al , 2017).Убиквитилирование и ISGylation, ковалентное присоединение убиквитина и убиквитин-подобного модификатора (Ubl) ISG15 соответственно к белкам, являются важными посттрансляционными модификациями (PTM) в антивирусных и воспалительных сигнальных путях врожденного иммунитета хозяина (Swatek & Komander, 2016). ISG15 – это стимулируемый интерфероном ген, экспрессия которого индуцируется после вирусной инфекции и важна для противовирусного ответа (Perng & Lenschow, 2018). PLpro ^SARS обладает уникальным механизмом действия, поскольку он распознает убиквитин в дополнительном сайте связывания убиквитина S2, чтобы связывать и отщеплять связанные с K48 цепи убиквитина от субстратов (Békés et al , 2015, 2016).ISG15 содержит два связанных домена Ubl, которые вместе напоминают диубиквитин, который может связываться с сайтами S1 и S2. Эти дополнительные протеазные активности PLpro противодействуют убиквитилированию и ISGилированию хозяина, эффективно подавляя противовирусную передачу сигналов и иммунный ответ хозяина. Эти многогранные роли PLpro делают его важным для репликации вируса, что делает его привлекательной терапевтической мишенью для COVID-19.

Учитывая большой размер Nsp3, PLpro и другие домены в Nsp3 были индивидуально охарактеризованы в деталях.Однако в большинстве исследований изучали только минимальный протеолитический домен PLpro, и мало что известно о влиянии других доменов в Nsp3 на активность и функцию протеазы. В настоящем исследовании мы проводим подробную биохимическую характеристику минимального PLpro ^CoV-2 и сравниваем его с протеазной активностью Nsp3 ^CoV-2 . Мы сделали неожиданное наблюдение, что удлиненный Nsp3 является более активной протеазой, с большей эффективностью расщепляющей как ISG15, так и K48-связанные цепи.Интересно, что хотя Nsp3 может очень эффективно расщеплять вирусный полипептид Nsp1-Nsp2, минимальный PLpro не может расщеплять этот гибрид. Чтобы найти ингибиторы PLpro, мы использовали высокопроизводительный анализ на основе MALDI TOF для скрининга соединений, одобренных FDA 1971 года, и выявления ингибиторов протеазы со значениями IC ₅₀ в диапазоне 1-10 мкМ. Несмотря на проявление хорошего ингибирования in vitro , ни один из ингибиторов не проявляет никакой эффективности в блокировании репликации вируса на модели вирусной инфекции SARS-CoV-2.Поэтому мы разработали нанотела, которые связываются с PLpro и ингибируют его в наномолярном диапазоне. Эти нанотела будут ценными инструментами для идентификации клеточных субстратов Nsp3 и исследования биологии Nsp3.

Результаты и обсуждение

Характеристика протеазной активности PLpro и Nsp3

PLpro представляет собой многофункциональный фермент с тремя различными протеазными активностями, которые катализируют расщепление (i) полиубиквитина, связанного с K48, (ii) ISG15 и (iii) вирусных полипептидов . Чтобы понять, как PLpro может расщеплять эти структурно отличные субстраты, и дополнительно охарактеризовать эти три активности, мы сначала создали соответствующие субстраты.Как ранее наблюдалось для PLpro ^SARS , PLpro ^CoV-2 также является селективным при расщеплении цепей, связанных с K48 ( рис. 1B, S1A ), и демонстрирует аналогичный способ расщепления путем расщепления триубиквитина на диубиквитин и моноубиквитин в качестве конечных продуктов. (Бекес и др. , 2015). Мониторинг расщепления proISG15, который несет пептид с 8 остатками на С-конце ISG15, показывает, что PLpro также очень активен по отношению к ISG15 (, рис. 1B, ). Процессинг вирусного полипептида включает расщепление между Nsp1-Nsp2, Nsp2-Nsp3 и Nsp3-Nsp4 ( рис. 1A, ).Чтобы контролировать расщепление вирусного полипептида, мы экспрессировали и очищали полноразмерный Nsp1, слитый с первыми 19 аминокислотами Nsp2 (Nsp1-2Δ). При использовании в качестве субстрата в анализах расщепления мы были удивлены, обнаружив, что PLpro не может расщеплять Nsp1-2Δ ( Fig. 1B ). Чтобы подтвердить это наблюдение, мы инкубировали увеличивающиеся концентрации PLpro с Nsp1-2Δ, который все еще был устойчив к расщеплению ( Fig. S1B ).

A) Анализ DUB , показывающий специфичность полиубиквитиновой связи PLpro.

B) Анализ, показывающий влияние увеличения концентрации PLpro на расщепление Nsp1-2Δ, визуализированное окрашиванием Кумасси.

C) Анализ, показывающий расщепление Nsp1-2Δ указанными конструкциями PLpro (1) и Nsp3 (2-5) (цветовая кодировка, как на фиг. 1A).

D) Выравнивание последовательностей С-концов всех субстратов PLpro с выделением сайта расщепления и консенсусного мотива узнавания.

E) Анализ расщепления, сравнивающий активность WT и C856A Nsp3 против K48-связанного Ub3.

F) Анализ, контролирующий превращение PLpro и Nsp3 с помощью зонда HALO-Nsp1-prg.

G) Кинетика Михаэлиса-Ментен расщепления K48-Ub3 под действием PLpro и Nsp3.

A) Схема расщепления Nsp1-3 PLpro от вирусного полипептида и доменная структура Nsp3: Ubl (убиквитин-подобный домен), ADRP ( АДФ-рибоза фосфатаза, SUD (уникальный домен SARS), PLpro (папаин-подобная протеаза), NAB (домен связывания нуклеиновой кислоты), TM (трансмембранный домен), ZnF (мотив цинкового пальца).

B) Анализ расщепления , сравнивающий способность 50 нМ PLpro расщеплять 3 мкМ K48-связанный Ub3, proISG15 и Nsp1-2Δ, визуализированный окрашиванием серебром.

C) Кумасси-окрашенный гель конструкций Nsp3, используемых в этом исследовании, со схемой сопутствующих доменов (цветовая кодировка, как в 1A; двойная косая черта указывает на делецию).

D) Анализ расщепления , сравнивающий способность 50 нМ Nsp3 расщеплять 3 мкМ K48-связанного Ub3, ISG15 и Nsp1-2Δ.

E) Анализ расщепления, сравнивающий расщепление Nsp1-2Δ и Nsp1-2Δ мутанта G180A Nsp3.

F) Анализ протеазы, сравнивающий расщепление Nsp1-2 FL с помощью PLpro и Nsp3.

G) Анализ DUB , непосредственно сравнивающий расщепление Ub3 (верхний) и ISG15 (нижний) PLpro и Nsp3.

H) Анализ прямого сравнения расщепления Nsp1-2Δ PLpro и Nsp3.

I) DUB-анализ, показывающий предпочтение полиубиквитинового связывания Nsp3.

J) УФ-следы анализов гель-фильтрации (Superdex 200 3.2/300) Nsp3, наложенные на стандарты молекулярной массы.

K) Масс-фотометрический анализ с измерением молекулярной массы Nsp3.

Мы задались вопросом, могут ли элементы распознавания вне минимального домена PLpro быть ответственными за обнаружение и расщепление Nsp1-2Δ. Nsp3 представляет собой мультидоменный белок, содержащий трансмембранный сегмент, который опосредует его локализацию в мембранных везикулах ( Fig 1A ) (Imbert et al , 2008; Lei et al , 2018). В дополнение к протеазному домену Nsp3 содержит N-концевой Ubl (убиквитин-подобный домен), за которым следует ADRP (ADP-рибозо-фосфатаза, домен SUD (SARS-уникальный домен), другой домен Ubl, который является частью PLpro.C-конец протеазы представляет собой домен NAB (связывающий нуклеиновую кислоту), за которым следует TM (трансмембранный сегмент) и домен ZnF (цинковый палец) на самом C-конце (Lei et al. , 2018; Tan et al. , 2009 г.). Несмотря на то, что это большой мультидоменный белок, мы получили миллиграммы чистых и стабильных рекомбинантных усечений Nsp3, когда мы либо удалили, либо заменили трансмембранный сегмент и кислотный участок на N-конце линкером ( Fig 1C ). Поскольку все варианты Nsp3 были одинаково активны ( фиг. S1C ), для дальнейшей характеристики были выбраны остатки 179-1329, охватывающие Nsp3 (далее обозначаемые как Nsp3).Сначала мы сравнили эффективность расщепления трех субстратов с использованием 50 мкМ Nsp3, той же концентрации, что и PLpro, используемого в Fig 1B , которое показало, что расширенные версии Nsp3, в отличие от PLpro, активно расщепляют все три субстрата, включая Nsp1-2Δ ( Fig 1D ). С-конец всех субстратов PLpro содержит мотив -GG с расщеплением PLpro после последнего Gly ( Fig S1D ). Действительно, мутация C-концевого G180 Nsp1 делает его устойчивым к расщеплению Nsp3, как и мутация каталитического C856 Nsp3 в Ala ( Рис. 1E, S1E ), подтверждая, что расширенный Nsp3 поддерживает субстратную специфичность и не содержит дополнительных каталитические сайты протеаз.Затем мы сделали пропаргилированный Nsp1 (Nsp1 ^Prg ), реактивный зонд, который будет ковалентно модифицировать каталитический Cys PLpro и Nsp3 (Ekkebus et al , 2013). Действительно, в то время как Nsp3 был эффективно модифицирован Nsp1 ^Prg , практически не наблюдалось никакого превращения для PLpro ( Fig S1F ). Протестированный субстрат Nsp1-2 содержит только 19 аминокислот из Nsp2. Чтобы проверить, имеет ли значение присутствие интактного Nsp2, мы экспрессировали и очищали слияния полной длины Nsp1-Nsp2.При использовании в качестве субстрата мы снова обнаруживаем, что PLpro все еще неспособен расщеплять этот субстрат, тогда как Nsp3 эффективно расщепляет его ( Fig 1F ).

Затем мы сравнили активность PLpro и Nsp3 для каждого из субстратов в качественных анализах на основе геля. В случае полиубиквитина почти весь триубиквитин расщепляется Nsp3 (50 нМ) через 15 минут, тогда как значительная часть еще должна расщепляться PLpro (, рис. 1G, , вверху). Точно так же Nsp3 (20 нМ) расщепляет большую часть про-ISG15 за 15 минут, в то время как только ~ 50% расщепляется PLpro ( рис. 1G, нижний ).С субстратом Nsp1-2Δ Nsp3 (1 мкМ) способен расщепляться, в то время как PLpro – нет ( Рис. 1H ). Эти качественные анализы позволяют предположить, что Nsp3 является более активным ферментом. Чтобы подтвердить эти наблюдения, мы использовали анализ DUB на основе MALDI TOF (Ritorto et al , 2014), который показывает, что PLpro эффективно расщепляет тримеры K48 с помощью тримеров K _m из 29,39 µ M, a V _макс 0,66 мкМ * мин ^-1 и ак _cat 22 мин ^-1 ( Fig S1G ).Напротив, Nsp3 расщепляет связанный с K48 триубиквитин с помощью K _m 17,79 µ M, V _max 0,62 мкМ * min ^-1 и ak _cat 20,6 минут ^{– 1} . Сравнительно более низкое значение K _m Nsp3 потенциально объясняет наблюдаемую более высокую активность расщепления. Несмотря на то, что Nsp3 более активен, чем PLpro, он все еще сохраняет свою специфичность в отношении расщепления K48-связанного полиубиквитина и не расщепляет никакие другие протестированные связи ( Fig. 1I, ).

Несмотря на несколько попыток, нам не удалось кристаллизовать более длинные варианты Nsp3 самостоятельно или в комплексе с субстратом. Интересно, что Nsp3 элюируется с кажущейся молекулярной массой ~ 520 кДа на колонке для эксклюзионной хроматографии, что повышает вероятность того, что он может быть тетрамером ( Fig. 1J ). Однако масс-фотометрический анализ показывает, что Nsp3 является мономером ( Fig. 1K ), предполагая, что поведение при гель-фильтрации можно отнести к расширенной конформации или содержанию спиральной спирали в Nsp3.Получение структуры Nsp3 в комплексе с его субстратом может показать, почему он более активен по сравнению с PLpro и почему он может расщеплять Nsp1-Nsp2.

Интерактом PLpro и Nsp3

Поскольку мы наблюдаем различия в активности протеаз между Nsp3 и PLpro, мы затем хотели сравнить интерактомы PLpro и Nsp3. На сегодняшний день большинство попыток всестороннего определения интерактомов неструктурных белков SARS-CoV-2 не смогли идентифицировать интерактом Nsp3 (Gordon et al , 2020).Когда мы экспрессировали полноразмерный Nsp3 в клетках HEK 293, мы наблюдали очень низкие уровни экспрессии, что затрудняло получение достаточного количества материала для анализа аффинного обогащения / масс-спектрометрии (AE / MS). Следовательно, мы сделали усечение, удалив трансмембранные сегменты Nsp3 (Nsp3 ΔTM). Линию эпителиальных клеток легких A549 трансфицировали либо с помощью Strep-меченного Nsp3 TM, либо PLpro, и клетки лизировали после стимуляции IFN-α в течение 36 часов.

Количественный масс-спектрометрический анализ показал, что Nsp3 ΔTM и PLpro имели в значительной степени перекрывающийся интерактом ( Рисунок 2) .Интересно, что многие из интеракторов, обогащенных как PLpro, так и NSP3 ΔTM, стимулируются интерфероном и белками, участвующими в передаче противовирусных сигналов. С его предпочтением расщеплять ISG15, мы наблюдали ISG15 как значимый интерактор, который также был идентифицирован в интерактоме PLpro ^CoV-2 (Shin et al , 2020). Другие известные перекрывающиеся взаимодействия включают IFIT (интерферон-индуцированный белок с тетратрикопептидными повторами), IFIT1 и IFIT2, противовирусные белки, которые функционируют как сенсоры вирусных одноцепочечных РНК для подавления экспрессии вирусных матричных РНК (Diamond & Farzan, 2013).Nsp3 ΔTM также взаимодействует с противовирусными белками SAMHD1, которые связываются с нуклеотидами и истощают клеточные dNTP, и 1′-5′-олигоаденилатсинтазой 3 (OAS3), другим индуцированным интерфероном геном, который ингибирует репликацию вируса за счет разрушения вирусной РНК (Li et al. al , 2016). Кроме того, как PLpro, так и Nsp3 ΔTM взаимодействуют с многофункциональной АТФ-зависимой РНК-геликазой DDX3X, которая способствует активации IRF3, что приводит к продукции интерферонов типа I, IFN- α и IFN- β (Soulat et al , 2008).

Volcano, показывающий значимые взаимодействия, идентифицированные путем извлечения Nsp3 ΔTM или PLpro из временно трансфицированных клеток с последующей количественной масс-спектрометрией. Интерактивные элементы, обогащенные раскрывающимися списками PLpro, выделены синим, а те, которые обогащены раскрывающимися списками Nsp3, выделены красными кружками.

Наши данные также идентифицируют интеракторы, связанные с трансляцией (EIF5A2, EIF2S1, ICE1, EIF2S3L) и актиновый цитоскелет (Cofilin-1, тубулины, KIF9, MYL4, PDLIM5), что также наблюдалось в недавнем исследовании с использованием метки близости ( Laurent et al , 2020).Хотя большинство интеракторов в значительной степени перекрываются между Nsp3 ΔTM и PLpro, мы идентифицируем РНК-связывающий белок 1, связанный с синдромом умственной отсталости Fragile X (FXR1), как обогащенный только Nsp3 ΔTM. Интересно, что Nsp3 из вируса Sindbis взаимодействует с FXR1, чтобы связывать вирусные РНК для сборки вирусных репликационных комплексов (Kim et al , 2016).

Несмотря на наличие нескольких дополнительных доменов, никаких дополнительных уникальных взаимодействий для Nsp3 ΔTM выявлено не было. Мы объясняем отсутствие дополнительных взаимодействий с Nsp3 ΔTM следующими возможностями: (i) Nsp3, используемый в наших экспериментах, не имеет трансмембранного сегмента и, следовательно, не локализуется в правом субклеточном компартменте, где могут присутствовать соответствующие клеточные взаимодействия Nsp3; (ii) большинство взаимодействий с Nsp3, i.е., домен Ubl1, домен SUD и макродомен связаны с РНК или АДФ-рибозой, и (iii) Nsp3 предположительно функционирует как каркас, опосредующий связывание с другими Nsps с образованием репликативных органелл, что объясняет отсутствие взаимодействий с белками человека. . Действительно, Y2H идентифицировал несколько взаимодействий Nsp3 с другими вирусными Nsp, но функциональные последствия этих взаимодействий для жизненного цикла вируса неясны (Pan et al , 2008; Imbert et al , 2008; von Brunn ). et al , 2007).

Идентификация и характеристика ингибиторов PLpro

Мы использовали ранее разработанный анализ MALDI-TOF DUB (Ritorto et al , 2014), чтобы оценить способность одобренных FDA лекарств 1971 года ингибировать PLpro от SARS-CoV-2. Важно отметить, что биоактивность и безопасность этих соединений были проверены в клинических испытаниях, что позволило быстро использовать любые эффективные соединения в терапии для лечения COVID-19. По сравнению с другими подходами на основе флуоресценции, анализ на основе MALDI-TOF имеет преимущество использования тримеров убиквитина K48, физиологического субстрата Plpro, для высокопроизводительного скрининга (HTS) (De Cesare et al , 2020).Кроме того, конечными продуктами, образующимися при расщеплении триубиквитина, являются диубиквитин и моноубиквитин, что делает их совместимыми для анализа с использованием анализа MALDI DUB. Реакцию останавливают добавлением 2% TFA и ¹⁵ N убиквитина. Чтобы избежать вариабельности от точки к точке, типичной для обнаружения на основе MALDI-TOF, сигнал моноубиквитина нормализуется до сигнала внутреннего стандарта ¹⁵ N ( Рисунок 3A, ). Библиотека одобренных FDA лекарств была проверена в двух экземплярах при концентрации 10 мкМ.Значение Z ’обычно используется для определения устойчивости HTS, причем значения Z’ больше 0,5 указывают на надежность анализа (Zhang et al , 1999). Анализ MALDI-TOF DUB дал среднее значение Z ’0,77 ± 0,12 (, фиг. 3B, ). Соединения, возвращающие процентные значения ингибирования> 50%, были идентифицированы как совпадения, и 30 соединений соответствовали этому критерию (частота совпадений 1,5%) (, фиг. 3B, ). Удачные соединения были отобраны и повторно протестированы в 10-точечной дозе-ответной реакции для определения значений IC ₅₀ в отношении как PLpro, так и Nsp3.Результаты на основе MALDI-TOF были дополнительно подтверждены ортогональными гелевыми анализами с использованием триUb, связанного с K48, и про-ISG15 в качестве субстрата ( Рисунок 3D; S3A-C ).

Ортогональные гелевые анализы с использованием тримеров K48 ( A, B ) и про-ISG15 ( C ). Тидеглусиб (TID), дисульфирам (DSF), нордигидрогваяретиновая кислота (NDA), тиогуанин (6TG), метимазол (MIZ), бацитрацин (BAC), леналидомид (LEN), ауранофин (AUR) и Iniparib (INI) были испытаны в указанные концентрации относительно PLpro ( A ) и NSP3 ( B , C ). D) Анализ, проверяющий способность GRL0617 ингибировать расщепление Nsp1-2 FL под действием Nsp3

A) Схема рабочего процесса анализа MALDI-TOF DUB. Тример K48 инкубируют с PLpro в течение 30 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливают добавлением 2% TFA и ¹⁵ N убиквитина (в качестве внутреннего стандарта). Ферментативную активность и ингибирование оценивали с помощью MALDI-TOF MS с обнаружением сигналов убиквитина и ¹⁵ N убиквитина.

B) FDA одобрило скрининг библиотеки соединений по MALDI-TOF, баллу Z’Prime и распределению данных HTS.

C) Расчет IC50 соединений, возвращающих значения ингибирования> 50% в HTS: тиогуанин, нордигидрогваяретиновая кислота, дисульфирам, ауранофин и тидеглусиб. IC50 рассчитывали как для PLpro, так и для NSP3 с использованием анализа MALDI-TOF DUB.

D-E) Ортогональные гелевые анализы, проверяющие активность протеаз PLpro и Nsp3 в отношении тримера K48 и pro-ISG15 в качестве субстратов.Нордигидрогваяретиновую кислоту (NDA), дисульфирам (DSF), ауранофин (AUR) и тидеглусиб (TID) тестировали при указанных концентрациях в сравнении с PLpro и NSP3

F) Расчет IC50 GRL0617 по сравнению с PLpro и NSP3.

G) Оценка селективности положительных совпадений GRL-0617 и HTS против панели из 42 человеческих DUB и вирусной опухоли яичника (vOTU). Соединения тестировали при конечных концентрациях 10 и 1 мкМ M.

На основании этих анализов была подтверждена способность пяти соединений ингибировать PLpro и Nsp3 in vitro (уровень подтверждения = 16.6%): тиогуанин, нордигидрогваяретиновая кислота, дисульфирам, ауранофин и тидеглусиб (, рис. 3C, ). Тиогуанин ингибирует PLpro и Nsp3 с IC ₅₀ 4,54 и 8,67 µ M соответственно в анализе на основе MALDI-TOF. Интересно, что, несмотря на этот разумный IC ₅₀ , мы не смогли наблюдать ингибирование PLpro тиогуанином в анализе на основе ортогонального геля. Интересно, что ранее было обнаружено, что тиогуанин ингибирует PLpro ^SARS (Báez-Santos et al , 2015) и Репликация SARS-CoV-2 (Swaim et al , 2020).

В наших анализах мы идентифицируем нордигидрогваяретиновую кислоту (NDA) как мощный ингибитор PLpro и Nsp3 с IC ₅₀ 1,06 и 1,62 мкМ M в анализе на основе MALDI-TOF. NDA – это соединение, извлекаемое из растений, используемое в традиционной медицине для лечения различных заболеваний, которое, как было обнаружено, подавляет многочисленные клеточные мишени (Manda et al , 2020). Его способность ингибировать ряд ферментов на основе цистеина связана с окислительно-восстановительными свойствами его двух катехоловых колец, что приводит к образованию аддуктов цистеина (Manda et al , 2020).Несмотря на его положительные эффекты, основным недостатком этого соединения является его потенциальная токсичность для почек и печени при длительном применении.

Дисульфирам – это тиокарбаматный препарат (коммерчески доступный как Antabuse®), который получил одобрение FDA для лечения алкоголизма и используется более 60 лет (Johansson, 1992). Дисульфирам ранее был идентифицирован с помощью скрининга in silico и анализа флуоресцентного резонансного переноса энергии для ингибирования основной Cys-протеазы SARS-CoV-2, Mpro (Lobo-Galo et al , 2020; Jin et al , 2020) .Дисульфирам также подавляет PLpro ^CoV2 и Nsp3 с аналогичной эффективностью: 0,69 и 0,66 мкМ M в анализе на основе MALDI-TOF и между 1 и 2,5 мкМ M при оценке с помощью ортогонального анализа на основе геля ( Рисунок 3D -E ). Также было обнаружено, что тидеглусиб, ингибитор гликоген-синтазы-киназы 3 (GSK3), ингибирует основную Cys-протеазу SARS-CoV-2 (Jin et al , 2020). Мы обнаружили, что тидеглусиб сильно ингибирует как PLpro, так и Nsp3 с IC50 0,21 и 1,48 µ M, соответственно, в анализе на основе MALDI-TOF.Аналогичная эффективность тидегусиба была также подтверждена в анализе на основе геля (, рисунок 3D-E ). Ауранофин – это золотосодержащее соединение, используемое для лечения ревматоидного артрита (Roder & Thomson, 2015), которое, как известно, подавляет воспаление и стимулирует клеточный иммунитет. Следует отметить, что недавно было показано, что ауранофин ингибирует репликацию SARS-CoV-2 в клетках человека (Rothan et al , 2020). Интересно, что мы обнаружили, что ауранофин сильно ингибирует PLpro и Nsp3 с эффективностью в диапазоне 1 µ M в анализе на основе MALDI-TOF с аналогичным паттерном ингибирования, наблюдаемым в анализе на основе геля ( Рисунок 3D-E ).Затем мы протестировали GRL-0617, нековалентный ингибитор, ингибирующий PLpro ^SARS , после вспышки SARS в 2002–2003 гг., С IC ₅₀ 0,6 µ M (Ratia et al , 2008 ). Мы обнаружили, что GRL-0617 также ингибирует PLpro с IC ₅₀ 2,21 µ M и Nsp3 с IC50 3,39 µ M ( Рисунок 3F ). Высокое сходство последовательностей между PLpro из SARS-CoV и SARS-CoV-2 и консервативный активный сайт объясняют, почему GRL-0617 ингибирует обе протеазы.

Геном человека кодирует около 100 деубиквитинирующих ферментов, большинство из которых являются цистеиновыми протеазами (Clague et al , 2019). Поскольку PLpro имеет общие архитектурные особенности с USP DUB, мы оценили селективность GRL-0617 и пяти положительных результатов HTS, протестировав их при конечных концентрациях 10 и 1 µ M на панели DUB, включающей 42 DUB человека и вирусная опухоль яичников (vOTU) из геморрагического вируса Крымского Конго. Неудивительно, что мы обнаружили, что дисульфирам, тиогуанин, NDA, тидеглусиб и ауранофин подавляли – в разной степени – несколько других человеческих DUB ( Рисунок 3G ), в то время как GRL-0617 показал большую специфичность с меньшим нецелевым ингибированием в панели протестированных DUB. ( Рисунок 3G ).Интересно, что GRL-0617 также способен ингибировать расщепление вирусного полипептида ( Рисунок S3D ). Присутствие высокореактивных химических групп, способных ковалентно модифицировать реактивные цистеины, может объяснять низкую специфичность этих небольших молекул. Несмотря на широкий диапазон активности этих соединений, их относительная безопасность была тщательно оценена в доклинических и клинических испытаниях FDA.

Затем мы проверили эффективность этих соединений в отношении ингибирования PLpro в клеточных анализах, измеряя активацию экспрессии интерферона с использованием репортера люциферазы IFN-β или способность ингибировать репликацию SARS-CoV-2 в клетках CaCo (Shin et al. , 2020).К нашему разочарованию, ни одно из соединений, кроме GRL-0617, не показало никаких эффектов ингибирования PLpro в клетках (данные не показаны). Эти результаты отличаются от результатов, полученных для некоторых из этих ингибиторов. Например, было показано, что использование ауранофина и тиогуанина ограничивает репликацию SARS-CoV-2 (Swaim et al , 2020; Rothan et al , 2020), но основной механизм действия не совсем понятен. Наши данные демонстрируют, что ауранофин и тиогуанин ингибируют деубиквитинирующую активность протеазы PLpro in vitro .Низкая эффективность идентифицированных хитов в ограничении репликации вируса предполагает, что перепрофилирование может быть неэффективной стратегией для идентификации ингибиторов, подходящих для клинической разработки, и для разработки специфических и эффективных ингибиторов PLpro / Nsp3 требуется систематический подход. Наши результаты, показывающие, что расширенные версии Nsp3 могут расщеплять вирусные полипептиды, которые минимальный PLpro не так эффективен, предполагают, что использование Nsp3 для скрининга ингибиторов может привести к идентификации аллостерических ингибиторов, которые могут ингибировать все три активности Nsp3.Несмотря на то, что они не очень эффективны сами по себе, комбинация лекарств, нацеленных на основные протеазы SARS-CoV-2 (PLpro и / или основную протеазу), с другими важными вирусными ферментами, такими как РНК-зависимая полимераза, может представлять собой терапевтическую стратегию.

Разработка нанотел, которые ингибируют PLpro

Поскольку все идентифицированные идентифицированные ингибиторы проявляют нецелевые эффекты и ингибируют другие человеческие DUB, мы хотели разработать другие способы избирательного ингибирования PLpro в качестве стратегии для исследования роли Nsp3 в вирусной жизни. цикла, вмешиваясь в передачу сигналов иммунной системы хозяина, и изучить, может ли ингибирование PLpro эффективно блокировать репликацию вируса.Ранее были разработаны варианты убиквитина (Ubv) для избирательного ингибирования DUB путем связывания с карманом S1 (Zhang et al , 2017; Gorelik & Sidhu, 2017). Следовательно, мы стремились создать нанотело, которое связывается с сайтом S1 с высоким сродством, чтобы ингибировать PLpro. Кроме того, сайт S1 важен как для деубиквитинирующей, так и для деISGилирующей активности PLpro (Békés et al , 2016). Поэтому мы использовали недавно разработанную библиотеку отображения нанотел на поверхности дрожжей, которая была недавно разработана для скрининга и идентификации нанотел (McMahon et al , 2018).Чтобы направить отбор нанотел к сайту S1, нам пришлось отказаться от нанотел, которые распознавали другие области PLpro. Следовательно, мы ввели этап отрицательного отбора с использованием PLpro ^CoV-2 , несущего мутации в сайте S1. Поскольку эти мутации были разработаны на основе доступной структуры PLpro ^SARS в комплексе с убиквитином (PDB 4MM3, (Ratia et al , 2014)) ( Fig S4A ), мы сначала проверили, влияют ли эти мутации также на PLpro ^{. Ков-2} . Действительно, по сравнению с WT мутант PLpro ^CoV-2 не реагировал на пропаргилированный Ub и был неспособен расщеплять связанный с K48 triUb ( Fig S4B-C ).После нескольких раундов отрицательного и положительного отбора с использованием сортировки с магнитно-активированными клетками (MACS), как показано в , фиг. 4A, , отдельные клоны дрожжей были протестированы на их связывание с PLpro (, фиг. 4B, ). Интересно, что мы идентифицировали несколько нанотел, которые связывались с WT PLpro ^CoV-2 , но не с мутантом сайта S1, предполагая, что эти нанотела специфически связываются с сайтом S1 (NbSL-17, -18, 19). Секвенирование этих нанотел выявило различия в петлях CDR1, CDR2 и CDR3 различных нанотел.

A) Схематический рабочий процесс выбора дисплея поверхности дрожжей для идентификации сайт-специфических нанотел как конкурентных ингибиторов Nsp3.

B) Анализ проточной цитометрии дрожжей, демонстрирующий нанотела против Nsp3 NbSL17, NbSL18 или NbSL19 соответственно. Дрожжи окрашивали анти-HA-Alexa488 против HA-меченного Nb и стрептавидин-Alexa647 против биотинилированных антигенов. Вверху: дрожжи, инкубированные с PLpro дикого типа, внизу: дрожжи, инкубированные с мутантом PLpro S1 *.Проценты указывают на долю дрожжей, положительных для обеих флуоресцентных меток.

C) УФ-следы и окрашенный кумасси SDS-PAGE анализов гель-фильтрации комплексов PLpro-Nb. Только PLpro (черный), PLpro + NbSL17 (оранжевый) и PLpro + NbSL18 (синий).

D-F) Изотермическое калориметрическое титрование для измерения связывания PLpro с NbSL18 (D), ISG15 (E) или K48-Ub2 (F).

G) Окрашенные серебром гели DUB-анализов PLpro (слева) и Nsp3 (справа) с K48-Ub3 (вверху) и proISG15 (в центре) и Nsp1-2 FL (внизу) в качестве субстратов в присутствии возрастающих концентраций из NbSL18.Окрашенные серебром гели SDS-PAGE. См. Также Рисунок S4 .

A) Структура SARS-CoV PLpro (синий), связанный с убиквитином (зеленый) (PDB 4MM3). Стик-модели показывают остатки мутантного сайта связывания S1 (золото) и каталитический цистеин C856. Ярлыки указывают на правую архитектуру PLpro с поддоменами Fingers, Palm и Thumb.

B) Гель, окрашенный Кумасси, сравнивающий реактивность PLpro WT и мутанта S1 * с Ub-prg

C) Анализ DUB PLpro WT и мутанта S1 * с K48-Ub3 в качестве субстрата, визуализированный окрашиванием серебром

DE) DUB-анализы PLpro (D) и Nsp3 (E) с K48-Ub3 (вверху) и proISG15 (внизу) в присутствии возрастающих концентраций NbSL17.

F) Выравнивание последовательностей идентифицированных ингибирующих нанотел NbSL17, NbSL18 и NbSL19 с синтетическим нанотелом Nb.201 (PDB 5VNV). Элементы вторичной структуры и расположение определяющих комплементарность областей (CDR) указаны над последовательностью.

Чтобы дополнительно охарактеризовать эти нанотела, они были рекомбинантно экспрессированы и очищены от бактерий. Из трех идентифицированных нами индивидуальных последовательностей нанотел растворимая экспрессия была получена только для двух нанотел (NbSL17 и NbSL18).Сначала мы выполнили аналитическую гель-фильтрацию, которая идентифицировала NbSL18 с образованием комплекса с PLpro ^CoV-2 (, рис. 4C, ). Используя калориметрию изотермического титрования (ITC), мы обнаружили, что аффинность связывания NbSL18 с PLpro ^CoV-2 составляет ~ 500 нМ ( Fig. 4D ). Интересно, что мы не наблюдаем никакого детектируемого связывания PLpro для K48-связанного diUb или ISG15 с помощью ITC ( Fig. 4E , F ). Поскольку NbSL18 связывается с PLpro с более высокой аффинностью по сравнению с K48-связанным diUb, мы затем оценили способность NbSL18 ингибировать PLpro.При увеличении концентрации NbSL18 расщепление K48-связанного triUb с помощью PLpro ингибируется с ~ 50% ингибированием при 500 нМ NbSL18, что согласуется с аффинностью связывания NbSL18 с PLpro ( рис. 4G, ). Напротив, для ингибирования расщепления ISG15 требуются более высокие концентрации NbSL18. Недавние кристаллические структуры ISG15 в комплексе с PLpro ^CoV-2 показывают, что C-концевой UBL ISG15 использует несколько иной способ взаимодействия по сравнению с убиквитином (Shin et al , 2020; Klemm et al , 2020) , что объясняет различия в ингибировании активности деубиквитилирования и деИСГилирования с помощью NbSL18.

Понимание того, как вирусный полипептид распознается Nsp3, и использование этого для ингибирования высвобождения зрелого Nsp1 / 2/3 может представлять собой законную стратегию подавления репликации вируса. Nsp1, например, играет ключевую роль в процессе инфекции, связываясь с субъединицами рибосомы 40S хозяина и блокируя канал мРНК своим С-концевым доменом, тем самым подавляя трансляцию белков-хозяев и изолируя рибосомы для трансляции вирусных белков. Следовательно, предотвращение созревания Nsp1 из вирусного полипептида может иметь жизненно важное значение для препятствования репликации вируса (Schubert et al , 2020; Thoms et al , 2020).Поэтому мы проверили, может ли NbSL18 также ингибировать расщепление слияний Nsp1-Nsp2 FL. Интересно, что наши данные показывают, что NbSL18 действительно может ингибировать расщепление Nsp1-2 FL с помощью Nsp3, предполагая, что вирусный пептид также занимает тот же сайт S1, что и убиквитин ( Fig. 4H ).

Определение кристаллической структуры NbSL18 в комплексе с Nsp3 или PLpro пролило бы свет на способ взаимодействия и позволило бы нам конструировать мутации, чтобы не только увеличить сродство связывания, но и избирательно ингибировать активность деубиквитилирования, деISGилирования или процессинга вирусных полипептидов.Однако, несмотря на несколько попыток, получить хорошо дифрагирующие кристаллы не удалось. Тем не менее, разработанные здесь нанотела могут быть ценными инструментами для анализа относительного вклада трех различных пептидазных активностей Nsp3 в репликацию вируса и инфекцию. Таким образом, наша работа выявляет различия в активности протеаз между минимальным PLpro доменом Nsp3 и более длинными версиями Nsp3 и подчеркивает необходимость изучения механизма Nsp3. Кроме того, текущие усилия по разработке ингибиторов сосредоточены исключительно на PLpro, и наши результаты показывают, что было бы важно оценить не только их эффективность при ингибировании полноразмерного Nsp3, но также способность протеазы расщеплять вирусные полипептиды.

Материалы и методы

кДНК ISG15 человека амплифицировали с помощью ОТ-ПЦР из универсальной эталонной РНК человека (Agilent 740000-41), добавляя сайты рестрикции BamHI и NotI на 5 ’и 3’ концах соответственно. Расщепленный продукт ПЦР клонировали в pGEX6P1, разрезанный теми же ферментами, чтобы получить pGEX6P1 ISG15 (DU8371).

кДНК убиквитина амплифицировали из существующего клона DU8724 (pET15b 6His 3C Ubiquitin), добавляя сайты рестрикции NdeI и BamHI на 5 ’и 3’ концах соответственно.Расщепленный продукт ПЦР клонировали в pET24a, разрезанный теми же ферментами, чтобы получить убиквитин pET24a (DU20027).

кДНК, кодирующие остатки SARS CoV-2 (MN7.3) Nsp3 743-1072 (PL-pro) и остатки SARS CoV-2 Nsp3 743-1072 (PL-pro) E912R E948R M953E Y1013K были синтезированы NBS Biologicals ( www.nbsbio.co.uk) с сайтами 5 ‘BamHI и 3’ NotI. Последовательности были оптимизированы по кодонам для бактериальной экспрессии. Их субклонировали в рецепторный вектор pETDuet 6His TEV GST 3C AVi (DU68478), расщепленный BamHI и NotI, чтобы получить pETDuet 6His TEV GST 3C AVi SARS CoV-2 Nsp3 PL-pro (DU67765) и pETDuet 6His TEV GST 3VC AVi Nsp3 PL-pro E912R E948R M953E Y1013K (DU67766).

pETDUET 6HIS TEV GST 3C SARS-CoV-2 Nsp3 743-1072 (PL-pro) (DU67811) получали путем удаления последовательности тега avi из DU67765 с помощью мутагенеза ПЦР.

кДНК, кодирующая SARS CoV-2 Nsp1 1-180 Nsp2 1-19 8His, была синтезирована GeneArt (Thermo Fisher Scientific) с добавлением сайтов NcoI и NotI на 5 ’и 3’ концах соответственно. Эту последовательность субклонировали в pET28a, чтобы получить pET28a SARS-CoV-2 Nsp1 1-180 Nsp2 1-19 8His (DU67799).

pTXB1 Halo 3C SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nsp1 1-179-Intein CBD (DU67780 был получен с использованием NEBuilder (New England Biolabs), амплификации вектора из существующего клона DU28033 (pTXB1-HALO-Mxe Intein-CBD) ) и вставка Nsp1 1-179 из существующего клона DU66413 (pGEX6P1 2019-nCoV Nsp1).

pET15D Twinstrep 3C Nsp3 N179-N1329 6His (DU67831) получали с использованием NEBuilder, амплифицируя вектор из существующего клона DU67810 (pET15D Twinstrep 3C 6His) и последовательность вставки Nsp3 179-1329 Nsp3 179-1329 из плазмиды Addgene pSD-ON-R 142012 pSD-2 .

pET15D Twinstrep 3C Nsp3 1-109 Линкер 179-1329 6His (DU67844) был получен с использованием NEBuilder, амплифицируя вектор из DU67831 и Nsp3 1-109 с линкерной последовательностью из плазмиды Addgene 141257 pDONR207 SARS-CoV-2 Nsp3.

pET15D Twinstrep 3C Nsp3 N179-N1329 Линкер 1584-1944 6His (DU67847) был получен с использованием NEBuilder, амплифицируя вектор из pET15D Twinstrep 3C Nsp3 179-1329 6His (DU67831) и линкер + последовательность Nsp3 1584-19 pDONR207 SARS-CoV-2 Nsp3.

pET15D Twinstrep 3C Nsp3 A1-N1329 Linker 1584-1944 6His (DU67881) был получен с использованием NEBuilder, амплификации вектора из существующего клона pET15D Twinstrep 3C-6His (DU67810) и вставки Nsp3 A1-N1329 Linker из существующего клона 1584-1944 pcDNA5D FRT / TO Twinstrep 3C Nsp3 A1-N1329 Линкер 1584-1944 6His IRES HA Nsp1 M1-G180 (DU67868).

pET15D Twinstrep 3C SARS-CoV-2 Nsp3 N179-N1329 6His C856A (DU67898) был получен путем добавления мутации C856A к клону DU67831 с использованием мутагенеза ПЦР.pET15D 8His GST 3C Nsp1-Nsp2 (DU70079) был получен путем повторной амплификации последовательности Nsp1-Nsp2 из существующего клона pcDNA5 FRT / TO Sars CoV-2 Nsp1-Nsp2-Nsp3 A1-G1944-GFP (DU70082) (сгенерированный непосредственно NEBuilder), переваривание BamHI и NotI и клонирование в существующую плазмиду pET15D 8His GST (DU70054), разрезанную теми же ферментами.

pcDNA5D FRT / TO mCherry (DU41458) был получен путем амплификации последовательности mCherry плюс mcs и клонирования в сайты BspTI и NotI pcDNA5D FRT / TO (DU41459), производного pcDNA5 FRT / TO (Thermo Fisher).

pcDNA5D FRT / TO Twinstrep 3C Nsp3 A1-N1329 Linker 1584-1944 6His (DU67879) был получен путем повторной амплификации Twinstrep 3C Nsp3 A1-N1329 Linker 1584-1944 6His из pcDNA5D FRT TO Twinstrep 3C Nsp329 A1His Linker 1584-1944 6His IRES HA Nsp1 M1-G180 (DU67868) (сделано NEBuilder) и клонирование в pcDNA5D FRT / TO (DU41459) BglII / NotI в BamHI / NotI.

pcDNA5D FRT / TO Twinstrep 3C SARS CoV-2 Nsp3 743-1072 (PL-pro) (DU67916) был получен путем удаления HA и замены Twinstrep 3C с использованием сайт-направленного мутагенеза Q5 (New England Biolabs E0552S) в pcDNA5D FRT / К HA SARS-CoV-2 Nsp3 743-1072 (PL-pro) (DU67767).pcDNA5D FRT / TO HA SARS-CoV-2 Nsp3 743-

1072 (PL-pro) (DU67767) был получен путем клонирования синтезированной последовательности SARS-CoV-2 Nsp3 743-1072 (PL-pro) в pcDNA5D FRT / TO HA (DU41456) с использованием BamHI / NotI.

Все реакции ПЦР проводили с использованием ДНК-полимеразы KOD Hot Start (Novagen). Все ОТ-ПЦР проводили с использованием набора PrimeScript High Fidelity RT-PCR компании Takara (R022A).

Секвенирование ДНК было выполнено MRC PPU DNA Sequencing and Services, School of Life Sciences, University of Dundee (www.dnaseq.co.uk).

См. Таблица S1 для обзора конструкций, используемых в этом исследовании. Все описанные здесь конструкции могут быть получены из https://mrcppu-covid.bio/

Экспрессия и очистка белка

Все рекомбинантные белки были экспрессированы в клетках E. coli BL21-CodonPlus (DE3). Бактериальные культуры выращивали в среде 2x TY с добавлением 100 µ мкг / мл ампициллина до OD ₆₀₀ 0,6-0,8 при 37 ° C в инкубаторах с встряхиванием. Экспрессию белка индуцировали добавлением 300 мкМ M IPTG с последующей инкубацией в течение ночи при 18 ° C.Клетки собирали при 4200 об / мин в течение 30 минут и осадки суспендировали в буфере для лизиса (50 мМ трис-HCl pH 7,5, 300 мМ NaCl, 10% глицерин, 0,075% об. / Об. BME, 1 мМ бензамидин, 1 мМ AEBSF и полный раствор). таблетка коктейля ингибиторов протеазы (Roche). Затем ресуспендированные клетки лизировали ультразвуком и осветляли центрифугированием при 35000 g в течение 45 минут при 4 ° C.

His

Пептиды, высушенные в вакууме, восстанавливают в 17 мкл л 50 мМ TEABC (pH 8,0). 3 мкл безводного ACN и 4 мкл реагента TMT (32 мкг репортерной метки TMT) каждой репортерной метки TMT (набор TMT 10 plex, номер продукта: и A37725., Thermo Fisher Scientific) добавляли к каждому образцу и инкубировали при комнатной температуре на миксере Thermo при осторожном перемешивании (600 об / мин) в течение 2 часов. Мечение TMT было выполнено для каждого образца, поскольку HA-PLpro-образец 1-3 был помечен как 126, 127N и 127C, а образец HA-Nsp3 1-4 = 3 был помечен как 128N, 129C и 129N и HA-пустой образец 1-3 были помечены репортерными тегами 129C, 130N и 130C. Затем к каждому образцу добавляли еще 25 мкл мкл 50 мМ TEABC и инкубировали еще 10 минут.Эффективность маркировки TMT была подтверждена путем взятия 5 µ л из каждого образца, помещенного в новую пробирку для сбора, и немедленной вакуумной сушки и обессоливания с использованием наконечника C18 Stage, как описано ранее (Berndsen et al , 2019). Было установлено, что эффективность маркировки TMT составляет> 99%. Далее, каждый образец гасили добавлением 2,5 мкл мкл 5% гидроксиламина и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. После этого образцы были объединены и высушены в быстром вакууме. Объединенный пептидный гидролизат, меченный TMT, подвергали мини-фракционированию на микроколонке с обращенной фазой с высоким pH, как описано в (Ruprecht et al , 2017; Berndsen et al , 2019).Всего было приготовлено 8 фракций и объединено в окончательные четыре фракции (FR1 + FR4, FR2 + FR5, FR3 + FR7 и FR4 + FR8), высушены в вакууме и подвергнуты анализу LC-MS / MS.

Анализ LC-MS / MS

Объединенные фракции bRPLC на основе микроколонок восстанавливали в 15 мкл 0,1% муравьиной кислоты и 3% буфера ACN и подвергали анализу LC-MS / MS / MS на Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass. спектрометр, который сопряжен с системой жидкостной хроматографии 3000 RSLC nano. Образец загружали в колонку для улавливания 2 см (PepMap C18 100A – 300 мкм мкм.Номер детали: 160454. Thermo Fisher Scientific) при скорости потока 5 мкл / мин с использованием загрузочного насоса и анализ на аналитической колонке 50 см (колонка EASY-Spray, внутренний диаметр 50 см × 75 мкм, номер детали: ES803) при скорости потока 300 нл / мин. скорость, которая подключается к масс-спектрометру с помощью источника Easy nLC и электрически распыляется непосредственно в масс-спектрометр. Градиент ЖХ применяли от 3% до 30% растворителя-B при скорости потока 300 нл / мин (Растворитель-B: 80% ACN) в течение 105 минут и от 30% до 40% растворителя-B в течение 15 минут и от 35% до 99% растворитель-B в течение 5 минут, который поддерживают на уровне 90% B в течение 10 минут и промывают колонку при 3% растворителе-B в течение еще 10 минут, включая в общей сложности 140-минутный пробег с 120-минутным градиентом в зависимом от данных MS3 режим (FT-IT CID MS2-FT MS3).MS1 полного сканирования был получен с разрешением 120 000 при m / z 200 и измерен с помощью масс-анализатора Orbitrap со сверхвысоким полем. 10 лучших ионов-прекурсоров были нацелены на MS2, а 10 лучших ионов-фрагментов были выделены путем включения синхронного выбора прекурсора для MS3 и проанализированы с помощью масс-анализатора Orbitrap со сверхвысоким полем. Ионы-предшественники выделяли с использованием квадрупольного масс-фильтра с масс-окном 0,7 Да, а спектры MS2 фрагментировали с использованием индуцированной столкновениями диссоциации и регистрировали с помощью масс-анализатора Iontrap в быстром режиме.Верхние 10 фрагментов ионов с изоляционным окном 1,2 Да были изолированы и фрагментированы с использованием столкновительной диссоциации (HCD) пучкового типа при нормированной энергии столкновения 65% и проанализированы с помощью масс-анализатора Orbitrap со сверхвысоким полем с разрешением 50 000 при m / z 200. Мишени AGC были установлены как 2E5 для MS1, 2E4 для MS2 и 5E4 для MS3 с инжекциями ионов 100 мс, 54 мс и 120 мс соответственно.

Анализ данных масс-спектрометрии и биоинформатический анализ

Пакет программ MaxQuant (Тянова и др. , 2016) версия 1.6.10.0 использовался для поиска в базе данных со следующим параметром. Репортерный ион типа MS3: 9plex TMT с толерантностью к массе репортерного иона 0,003 Да. Поправочные коэффициенты изотопного репортерного иона TMT вводились вручную, как указано производителем. Были использованы следующие параметры, специфичные для группы: Использовалась встроенная поисковая машина Andromeda, указав трипсин / P в качестве конкретного фермента, допуская 2 пропущенных расщепления, минимальная длина 7 аминокислот, окисление (M), ацетил (белок-N -терминал), дезамидирование N и Q были выбраны в качестве изменяемых модификаций.Карбамидометилирование Cys было выбрано в качестве фиксированной модификации. Был выбран первый допуск поиска 20 ppm и основной допуск поиска 4,5 ppm. Глобальные параметры: База данных Uniprot Human с добавлением SARS-COV-2 NSP3 с двойным strep-тегом (выпуск 2017-02; 42,101 последовательности) использовалась для поиска в базе данных, и был применен FDR на уровне 1% пептидов и белков. Для количественного определения белка минимальное соотношение было установлено равным 2 для точного количественного определения репортерных ионов. Выходные текстовые файлы групп белков MaxQuant обрабатывали с помощью программного пакета Perseus (Tyanova et al , 2016), версия 1.6.10.45. Данные были отфильтрованы для любых белков, которые помечены как обычные загрязнители и обратные попадания. Интенсивности репортерных ионов TMT были преобразованы в log2, и впоследствии репортерные метки TMT PLpro, NSP3 и контрольные условия были разделены на категории для проведения статистического анализа. T-тест Велча для двух выборок был выполнен с применением 5% -ной перестановки FDR для идентификации дифференциально обогащенных и значимых групп белка между HA-PLPro по сравнению с контрольными и HA-NSP3 по сравнению с контрольными группами.Данные масс-спектрометрической протеомики были депонированы в Консорциум ProteomeXchange через партнерский репозиторий PRIDE (Perez-Riverol et al , 2019) с идентификатором набора данных PXD022904.

MALDI TOF assays

MTP Anchor Chip Планшеты-мишени 1536 BC (№ 8280787) и целевая рамка MTP (№ 8074115) были приобретены у Bruker Daltonics (Биллерика, Массачусетс). Матрица 2 ’, 5’-дигидроксиацетофенона (матрица DHAP) была приобретена у Tokio Chemical Industries (номер продукта: D1955).Растворители и реагенты для ЖХ-МС были приобретены у различных коммерческих поставщиков: ацетонитрил (Merck-Millipore – Кат. № 1.00030.2500), двухосновный цитрат аммония (Fluka – Кат. № 09833), ДМСО (Sigma-Aldrich – Кат. №: D8418), трифторуксусная кислота – TFA (Thermo Scientific – каталожный номер 85183). Анализ проводили в 384-луночном микропланшете, PS, малый объем, hibase, белый (Greiner bio-one – каталожный номер 784904) и покрытый алюминиевой фольгой Silverseal Sealer (Greiner Bio-One – кат. Номер 676090).Для приготовления матричного раствора DHAP 25 мг гидрогенцитрата диаммония растворяли в 1 мл воды milliQ. 7,6 мг матрицы DHAP растворяли в растворе 375 мкл этанола для ЖХ-МС и 125 мкл раствора гидрогенцитрата диаммония с помощью интенсивного встряхивания.

Ферментативные реакции и высокопроизводительный скрининг (HTS) MALDI-TOF были настроены в анализе, как описано ранее (De Cesare et al , 2020). Вкратце, одобренная FDA библиотека соединений была доставлена ​​в планшеты с 384 лунками с использованием бесконтактной акустической доставки.Две колонки были зарезервированы для положительного (только ДМСО) и отрицательного контроля (без фермента). Тример PLpro и K48 убиквитина разбавляли в буфере, содержащем 40 мМ Трис (pH 7,5) и 0,01% BSA до конечной концентрации 1,2 нг / мкл и 0,2 мг / мл соответственно. 3 мкл мкл раствора PLpro помещали в 384-луночные планшеты с использованием системы FluidX XRD, оснащенной 16-канальными картриджами для трубок. Планшеты центрифугировали в течение 1 минуты при 1000 x g, накрывали алюминиевой герметизирующей фольгой для предотвращения испарения и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут.Реакцию начинали добавлением 3 мкл мкл тримера убиквитина K48 на весь аналитический планшет и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Реакцию останавливали добавлением 3 мкМ мкл TFA – конечная концентрация 2% (об. / Об.) С добавлением 4 мкМ ¹⁵ N меченного убиквитина. TTP Labtech Mosquito® HTS, оборудованный 5-позиционной платформой для планшетов, использовали для смешивания образца и матрицы DHAP и для нанесения смеси на мишень MALDI. Четыре 384-луночных планшета объединяли в один планшет-мишень Anchor Chip 1536 BC MALDI-TOF.Пятнистые и высушенные мишени MALDI подвергали автоматическому MALDI-TOF MS-анализу. Масс-спектры получали с помощью прибора RapifleX MALDI-TOF / TOF от Bruker Daltonics, оснащенного программным обеспечением Compass для FlexSeries 2.0. Масс-спектры получали в диапазоне масс m / z 8000–9200, чтобы включить сигналы убиквитина (8565,76 кДа) и ¹⁵ N убиквитина (8669,47 кДа). Было накоплено 4000 лазерных выстрелов на пятно образца в режиме положительной ионизации с использованием импульсной экстракции ионов 500 нс с частотой лазера 10 кГц, настройкой дигитайзера 5.00 Гвыб / с, и один параметр Smartbeam в диапазоне сканирования 800 µ м. Полученные спектры обрабатывались с детектированием пика центроида, установленным на отношение сигнал / шум (S / N), равным 5, и сглаживанием по Гауссу (0,5 m / z; 10 циклов). Сигнал ¹⁵ N убиквитина был добавлен в список контроля массы и использован в качестве внутреннего калибранта. Данные MALDI-TOF, обработанные с помощью flexAnalysis, были экспортированы в виде файла с разделителями-запятыми (.csv). Далее наборы данных обрабатывались с помощью Excel или GraphPad Prism (v7.03; Программное обеспечение GraphPad, Ла-Хойя, Калифорния). Активность PLpro отслеживали с использованием измеренной площади (сигнала) ферментативного продукта (убиквитина) и соответствующего меченого внутреннего стандарта ( ¹⁵ N убиквитина). Все точки данных были представлены как отношение сигнала убиквитина к сигналу внутреннего стандарта. Сгенерированные данные образца были выражены как процент от контроля (PoC) в соответствии со следующим уравнением: Были ли b средним значением для отрицательных контролей, а c – средним значением для положительных контролей.

Для оценки надежности и качества кампании по обнаружению попаданий был использован ключевой показатель, параметр Z ’(Zhang et al , 1999), как для следующего уравнения: Были ли σ _p, , σ _n , как стандартные отклонения положительного и отрицательного контроля, и µ _p , µ _n , как разность средних значений положительного и отрицательного контролей. GraphPad Prism использовался для графического представления данных.

Набор соединений, одобренных FDA: Apex bio DiscoveryProbe ™ одобренная FDA библиотека лекарств (Кат.L1021) представляет собой уникальную коллекцию малых молекул, одобренных FDA в 1971 году, с известными данными о биодоступности и безопасности для людей.

Защитные продукты – промышленные поставки

Выберите категорию Продукты безопасности COVID19 Дренажные трубки Пробирки для проверки газа Обнаружение асбеста – Обнаружение свинца , SCBA Строительная продукция Баррикада, сетка Электроинструменты Такелажные кабели Арматурные колпачки Мешки для оборудования электробезопасности Краски для маркировки, защитные ленты Контроль разливов, Сорбенты, Легковоспламеняющиеся хранилища, Бидоны для прекращения пожара, Воронки Контейнеры для прекращения огня Мешки для обезвоживания, дренажные ограждения, входные ограждения, защитные отстойники , Баллоны для хранения разливов Ящики для хранения Принадлежности для барабанов Шкафы для хранения легковоспламеняющихся веществ Сорбенты Контроль и хранение разливов, Поддоны для контроля разливов, Центр накопления в барабанах rs, Накопительные рампы для барабанаЭргономичная опора Опора для спины Локоть, опора для запястья и кисти Защита для ног, Защита для пальцев ног Опора для колена – опора для лодыжки Защита глаз и лица Защитные очки и защитные очки Экономичные защитные очки MCR Safety Tomahawk Series RADIANS Rad-Sequel Series Стандартные защитные очки Jackson Safety HellRaiser Серия Jackson Safety Nemesis Series MCR Safety Klondike Metal Series MCR Safety Storm Series Pyramex Avante Series Pyramex Cortez Series Pyramex Exeter Series Pyramex Mini Ztek Series Pyramex Venture II Series Pyramex Zone II Pyramex Ztek Series RADIANS DeWalt Series RADIANS DeWalt DC Dual Comfort RADIANS DeWalt DC Dual Comfort Radius Вентилятор RADIANS Rad-Infinity Series RADIANS Revelation Series RADI ANS Strike Force II SPERIAN A800 Series SPERIAN A900 Series SPERIAN UVEX Ignite Series Premium Safety Glasses JACKSON Safety Magnum 3G Series MCR Safety PRO Rubicon Series MCR Safety PRO Tremors Series SPERIAN UVEX Genesis Series OTG Защитные очки Считыватели Защитные очки Считыватели Pyramex V2 Pyramex Ztek Readers Безопасность при сварке Очки Защитные очки Аксессуары для очков Боковые щитки Очки Чехлы, чехлы и фиксаторы Очки для чистки линз Защитные очки Защитные очки Защитные очки Сварочные защитные очки и защитные очки Продукты для обслуживания оборудования, Фрезы для удержания и хранения ТОиР и электрические инструменты Противопожарные фонари и защитное освещение Товары для уборки, Промышленные товары Безопасность завода, Безопасность парковок, безопасность дорожного движения Оборудование для защиты от падения DBI Sala Fall Protection Equipmen t ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ОТ ПАДЕНИЙ MILLER Средства защиты от падения MSA Защита от падения PROTECTA от DBI Sala Защита от падения Ремни для защиты тела Защитные ограждения СИЗ Мешки СИЗ Оборудование для защиты от падения Комплекты для защиты от падения Ремни Ремни безопасности Системы защиты от падения Системы выдвижных ремней Противопожарная безопасность Противопожарные одеяла Огнетушители Пожарная безопасность Дым Детекторы Хранение горючих материаловПродукция первой помощи Продукты биобезопасности 3-слойные маски для лица Тестирование на наркотики Детекторы алкоголя Чашки для теста на наркотики Тесты на наркотики для пероральной жидкости Тесты на наркотики Экстренное реагирование Экстренные одеяла СЛР, дефибрилляторы Спасательные крючки Носилки Травматологические комплекты Для мытья глаз Шланги для экстренной помощи, душ для душа Капли для глаз Раствор для мытья глаз Первичная аварийная промывка глаз Вторичные станции экстренной промывки глаз Товары первой помощи Липкие ленты первой помощи В первую очередь Аэрозольные баллончики для оказания первой помощи. Первая помощь. Пакеты – Горячие пакеты Первая помощь Стерильные ватные палочки – Стерильные ватные палочки – Депрессоры для языка – Ватные шарики Первая помощь Эластичные бинты Первая помощь Перцовый спрей Первая помощь Форецепс Первая помощь Пинцет Первая помощь Марлевые салфетки – Марлевые компрессы Марлевые салфетки для первой помощи Первая помощь Ингалянты Инструменты первой помощи MDI CPR Microshields Первая помощь Мази Первая помощь Пластиковые бинты Аппликаторы для первой помощи Шины для первой помощи Плетеные бинты Защита кожи Симптомы для снятия лекарств Таблетки с лекарствами Антациды, облегчение пищеварения Холод Облегчение, облегчение гриппа, облегчение синуса Обезболивание, снятие воспаления Фонари – Защитное освещениеБезопасное напольное покрытие Обнаружение газа Обнаружение газа GASTEC Обнаружение газа SPERIAN Biosystems Обнаружение газа Технологии BW By Honeywell Обнаружение газа Обнаружение газа Honeywell MSA Калибровочные газовые баллоны Газоанализаторы Регуляторы Газоанализаторы Датчики Защита рук Химически стойкие перчатки , Латексные перчатки, Перчатки с покрытием из ПВХ, Перчатки с покрытием из нитрила, Перчатки с покрытием из ПВХ, устойчивые к порезам перчатки и рукава, Кевларовые перчатки Одноразовые перчатки, Одноразовые латексные перчатки, Одноразовые нитриловые перчатки, Напудренные перчатки, Неопудренные перчатки, Детские кроватки Рабочие перчатки общего назначения, Хлопок Рабочие перчатки, перчатки из джерси, парусиновые рабочие перчатки Термостойкие перчатки Аксессуары для рабочих перчаток, Одноразовые настенные органайзеры для перчаток Рабочие перчатки из кожи Специальные рабочие перчатки из ПВА, перчатки из EVOH, ламинированные рабочие перчатки Рабочие перчатки, перчатки для механиков Защита головы Аксессуары для защиты головы sories Защитные колпачки Каски Специальные каски Защита слуха, беруши Защитные ленты для слуха Проводные беруши Беруши без проводов Диспенсеры и заправки для беруш Наушники Сохранение слуха Теплозащитные банданы – Повязки для пота – Охлаждающие жилеты Охладители IGLOO, одноразовые диспенсеры для рабочей одежды IGLOOR Бумажные стаканчики, чашки IGLOOR , Одежда Hi-Viz, Защитные жилеты Аксессуары для спецодежды High-Vis Метлы Емкости для сигарет Промышленные чистящие средства Промышленные тряпки, промышленные полотенца, промышленные салфетки Блокировка / маркировка продуктов Блокировка / маркировка соответствия Блокировка / маркировка устройств Блокировка / маркировочные комплекты Блокировка / маркировка станций Блокировка / маркировка тегов Замки для блокировки / маркировки Морские буи Защитные устройства связи Спасательные жилеты Защитные заграждения для морских судов Защитная рабочая одежда – огнестойкая одежда – рабочая одежда Рабочая одежда для дуговой сварки Химически стойкая одежда Одноразовая рабочая одежда – одноразовые комбинезоны Рабочая одежда повышенной видимости Промышленные фартуки Лабораторные халаты Защитная рабочая одежда Рукава Сварочная одежда Зимняя рабочая одежда Рабочие комбинезоны Рабочие комбинезоны Рабочие куртки Рабочие брюки Рабочие рубашки Raingear Ponchos Дождевики – Куртки от дождя Комбинезоны от дождя Дождевики Средства защиты органов дыхания Средства защиты органов дыхания 3M Средства защиты органов дыхания ALLEGRO Средства защиты органов дыхания GERSON Средства защиты органов дыхания MOLDEX Средства защиты органов дыхания MSA Средства защиты органов дыхания NORTH Средства защиты органов дыхания SPERIAN Средства защиты органов дыхания Willson Тестирование полнолицевых респираторов Респираторы-полумаски PAPR , Поставляемые воздушные респираторы Аксессуары для защиты органов дыхания Картриджи для респираторов, фильтры для респираторов Защитные очки Защитные очки эконом-класса Защитные очки серии 3M OX Защитные очки 3M Virtua серии AP Защитные очки 3M Virtua Sport Защитные очки 3M Virtua серии V4 Защитные очки серии 3M Virtua V6 Защитные очки Cordova Boxer Series Cordova Bulldog Серия Cordova Citation Series Cordova Doberman Series Cordova Retriever II Series Cordova Slammer Series Crews Защитные очки Klondike Crews Law 2 Защитные очки RADIANS Защитные очки Rad-Sequel серии Radnor Защитные очки SPERIAN серии A400 Стандартные защитные очки Защитные очки серии 3M BX Защитные очки серии 3M Lexa 3M Защитные очки серии Nuvo Защитные очки серии 3M Privo Защитные очки серии 3M Virtua Sport CCS Защитные очки для экипажей Swagger Защитные очки JACKSON Safety Hel Серия lraiser JACKSON Safety Nemesis Series MCR Safety Desperado Series MCR Safety Storm Series Pyramex Avante Series Pyramex Solara Series Pyramex Venture II Series RADIANS DeWalt Series SPERIAN A700 Series SPERIAN A800 Series SPERIAN A900 Series SPERIAN UVEX Bandit защитные очки SPERIAN Falcon Защитные очки SPERIAN UVEX Байонетные очки Очки Защитные очки SPERIAN UVEX Защитные очки Mercury Защитные очки SPERIAN UVEX Защитные очки Женские очки Защитные очки SPERIAN серии W100 Sperian серии W200 Защитные очки премиум-класса Защитные очки серии 3M Maxim Защитные очки 3M Metaliks Спортивные защитные очки 3M Moon Dawg Очки Защитные очки 3M Smart Lens Экипажи Защитные очки ForceFlex Экипажи Hellion Safety Очки Crews Защитные очки Rattler Crews Защитные очки Triwear JACKSON Safety Magnum серии 3G Безопасность MCR Серия PRO Rubicon MCR Безопасность Серия PRO Tremor SPERIAN UVEX Защитные очки Adaptec SPERIAN UVEX Защитные очки Astrospec SPERIAN UVEX Flashback Защитные очки SPERIAN UVEX Предохранительные металлические очки SPERIAN UVEX Genesis Series SPERIAN UVEX Milennia Защитные очки SPERIAN UVEX Защитные очки Skyper SPERIAN UVEX Сейсмостойкие очки SPERIAN UVEX Сейсмостойкие очки SPERIAN UVEX Сейсмостойкие очки Защитные очки UVEX SolarPro Защитные очки SPERIAN UVEX Tomcat Защитные очки SPERIAN UVEX Защитные очки для паров OTG Защитные очки для считывателей Защитные очки 3M BX Dual Readers Защитные очки 3M Lexa Readers Защитные очки 3M Nuvo Series Защитные очки Экипажи Лупа Klondike Защитные очки Pyramex V2 Считыватели Pyramex Ztek Series Read SPERIAN A Readers Лупа Защитные очки Защитные очки Аксессуары для очков Боковые щитки для очков Футляры, чехлы и фиксаторы для очков Очищение линз для очков Безопасность при сварке Очки Защитная обувь Защитная обувь Аксессуары Резиновые сапоги, резиновые бахилыЗнаки безопасности Знаки допуска Двуязычные знаки Знаки биологической опасности Знаки безопасности Знаки химикатов Знаки безопасности в замкнутом пространстве Знаки строительства Электрические знаки Знаки окружающей среды Знаки выхода Знаки пожарной безопасности Знаки первой помощи Знаки инвалидности Знаки домашнего хозяйства Знаки блокировки / маркировки Знаки отсутствия курения Рабочие знаки Знаки парковки Знаки СИЗ Знаки радиации Знаки туалета Баннеры безопасности Идентификация безопасности Знаки стимулирования безопасности Этикетки безопасности Табло безопасности Табло безопасности Знаки безопасности Знаки Стенды Знаки безопасности дорожного движения Знаки маркировки транспортных средств Знаки складских знаков Светоотражающая лента безопасности Безопасность дорожного движения Защитные накладки ADA Защитные барьеры, системы барьеров для дорожного движения Безопасность дорожного движения Конусы, Посты-указатели безопасности дорожного движения Маркировка безопасности дорожного движения и ветроуказатели Одежда с высокой видимостью Знаки безопасности дорожного строительства, Стойки для знаков безопасности дорожного строительства Продукция для безопасности дорожного движения, Средства безопасности на стоянках Безопасность грузовиков, Безопасность транспортных средств Продукция Сварочные перчатки Сварочные маски Сварочная защитная спецодежда

Newsroom – BioscienceLA ​​

26 июля 2021 года USC сообщило, что в некоторых статьях о Маршалле есть выпускница.Некоторые подчеркивают успех в бизнесе, выходящий за рамки повседневного. Некоторые истории фокусируются на реальном влиянии и улучшении жизни.

Кэтрин Купер и Консорциум технологий и инноваций в педиатрии Западного побережья (CTIP), недавно ставшие объектами тематического исследования Пай-Линь Инь и Бенджамина Ростокера для Центра исследований предпринимательства Ллойда Грейфа, представляют все три. Дело «Кэтрин Купер и CTIP: повышение разнообразия в медицинских технологиях» было сосредоточено на пути увеличения разнообразия среди соискателей портфеля CTIP и заняло третье место в конкурсе Case for Women 2020, организованном Emerald Publishing.

Образовательный путь Купер привел ее из лаборатории лаборатории Калифорнийского университета в Гарвард-Уэстлейк, Стэнфорд, где она была принята в медицинскую школу им. Кека.

После нескольких лет учебы в Keck она переключилась на бизнес-мир стартапов в сфере здравоохранения; сначала в компании, занимающейся технологиями здравоохранения, затем в компании FIGS Medical Apparel по просьбе друга из Стэнфорда. Руководя развитием бизнеса, Купер поступил на программу MBA Marshall Online. Кульминация ее опыта в медицине и бизнесе, в том числе связей, установленных в USC, побудила ее проконсультироваться и в конечном итоге взять на себя роль содиректора с CTIP.

История Купера заключает в себе все, что угодно, кроме линейного пути, который многие видят для успеха в медицине или бизнесе, не говоря уже о их комбинации.

«Я никогда не ожидал, что стану участником тематического исследования», – сказал Купер. «Это обычно то, что обычно ассоциируется с руководителями компаний из списка Fortune 500, и может быть сложно думать о себе таким образом».

Развитие этой способности видеть себя в центре внимания кейса – и актуальность для студентов, которые, возможно, никогда не считали себя главными героями кейса, – было основной мотивацией для Купера.

Репрезентация – это возможность обучения

«Некоторые ученики видят, что их опыт и идентичность представлены все время в классе, и им никогда не приходится выходить за пределы себя, чтобы быть в центре истории», – сказал Купер. «Другие никогда не видят в представлении своего опыта или кого-либо, подобного им, и постоянно прилагают эти познавательные усилия, чтобы заняться делами, уроками в классе».

Ее пригласили выступить в двух классах по недавно опубликованному тематическому исследованию; бакалавриат и один на уровне MBA.

По ее словам, наибольшее влияние на нее оказали отзывы, которые она получила после занятий. Вопросы студентов, по сути, позволили ей «увидеть» дело и его влияние их глазами.

«Когда я говорила с классом бакалавриата, женщины, которые обычно не участвовали в обсуждениях в классе, были очень вовлечены в вопросы», – сказала она. «А на занятии MBA потом подошла женщина, чтобы рассказать, как это было вдохновляюще – узнать о чернокожих женщинах на руководящих должностях. У нас состоялась прекрасная беседа о возможностях инвестирования и инноваций.«

Участие студентов в этом деле означало, что оно прошло успешно, – сказала она.

«Цель взаимодействия с процессом рассмотрения дела – помочь другим понять и изучить инновации в сфере здравоохранения», – сказала она.

Обсуждая потенциальное дело с Инь, Купер также участвовала в качестве выпускницы в целевой группе DEI Центра Грейфа. Она обнаружила, что эти два опыта дополняют друг друга.

«Это был невероятный опыт, – сказал Купер, – давая возможность из первых рук увидеть, что делает Центр Грайфа для изменения преподавания предпринимательства.”

Добавляемая стоимость

Помимо того, что цветная женщина видит в ней предпринимательского игрока, дело CTIP помогает студентам понять роль, которую организация играет на рынках ускорителей и медицинского оборудования.

До прихода Купера в 2017 году CTIP, финансируемый Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA), в основном распределял гранты на инновации. Купер помог вести трансформацию и реорганизацию, поэтому он больше работал как акселератор и фонд микро-венчурных капиталовложений, хотя и использовал то же государственное финансирование.

«Подход Кэтрин гарантировал, что компании, которые она поддерживает в области педиатрических медицинских устройств, получили не только некоторое финансирование», – сказал Дэн Вадхвани, профессор клинического предпринимательства в Центре Грайфа, который преподавал этот случай, «но также и руководство и доступ к сеть для управления сложным процессом утверждения и коммерциализации ».

Вадхвани использовал пример CTIP в качестве «модели» для студенческих проектов. Группам студентов было поручено определить возможности в отрасли, в которой они могли бы оказать целевое влияние, а затем им были предоставлены гипотетические 5 миллионов долларов на разработку портфолио и разумной программы ускорения.

«Это оказался фантастический способ для студентов стратегически узнать об инновациях», – сказал Вадхвани.

«Все это было безумно, – сказал Купер. «Лучшим из возможных способов».

% PDF-1.4 % 181 0 объект > эндобдж 136 0 объект > поток DOI: 10.1073 / pnas.1414748111application / pdf10.1073 / pnas.1414748111 http://dx.doi.org/10.1073/pnas.14147481112014-09-06false10.1073/pnas.1414748111

0000000 конечный поток эндобдж 67 0 объект > эндобдж 32 0 объект > эндобдж 98 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / Properties> / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 76 0 R / Type / Page >> эндобдж 262 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 49 0 R / Type / Page >> эндобдж 127 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 144 0 R / Type / Page >> эндобдж 287 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 156 0 R / Type / Page >> эндобдж 159 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 288 0 R / Type / Page >> эндобдж 4 0 obj > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 162 0 R / Type / Page >> эндобдж 185 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 133 0 R / Type / Page >> эндобдж 36 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 137 0 R / Type / Page >> эндобдж 211 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 51 0 R / Type / Page >> эндобдж 72 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 85 0 R / Type / Page >> эндобдж 338 0 объект > поток HWv8} WQc1 ~ 鴥 t: ϙCSE * \ h ~ j) Yt

, Каталог конфигурационных факторов радиационной теплопередачи

, Обобщенный алгоритм с разделенным окном для получения температуры поверхности земли из космоса – Журналы и журнал IEEE

, Алгоритм разделения температуры и излучения для усовершенствованных изображений космического радиометра теплового излучения и отражения (ASTER) – Журналы и журнал IEEE

Л.Аделард, Моделирование температуры неба и приложения в моделировании зданий, Возобновляемая энергия 15, стр. 418-430, 1998.
URL: https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-00766267

Ф. Айрес, Дистанционное зондирование с помощью прибора инфракрасного зондирования атмосферы интерферометра 2. Одновременное получение атмосферных профилей температуры, водяного пара и озона, Журнал геофизических исследований, том 107, 2002.

Ф. Айрес, Новый подход к нейронной сети, включающий первые предположения для извлечения водяного пара в атмосфере, пути жидкой воды в облаках, температуры поверхности и коэффициентов излучения над сушей по данным спутниковых микроволновых наблюдений, Journal of Geophysical Research: Atmospheres, vol.106, pp.2156-2202, 2001.

и. Солвер, Труды Международной конференции по теории и приложениям компьютерной графики, стр.225-232, 2010.

А. Аппель, Некоторые методы рендеринга твердых тел с помощью машины затенения, Протокол конференции AFIPS, 1968.

Д. Аркес и С. Мишлен, Proximity Radiosity: Использование когерентности для ускорения вычислений с форм-фактором, en, in: Rendering Techniques ’96, pp. 143-152, 1996.

Дж. Н. Эш и Дж. Меола, Разделение температурно-излучательной способности для LWIR-зондирования с использованием MCMC, Алгоритмы и технологии для мультиспектральных, гиперспектральных и ультраспектральных изображений XXII, вып.9840, 2016.

, ASSIMP – Open-Asset-Importer-Lib

, Коды переноса атмосферного излучения, en, in: Wikipedia, p.881103099, 2019.

Д. Балагеас, Введение в структурный мониторинг здоровья, Структурный мониторинг здоровья, стр. 13-43, 2010 г.

А. М. Болдридж, Спектральная библиотека АСТЕР, версия 2.0 », en, Дистанционное зондирование окружающей среды, том 113, стр. 344257, 2009.

А. Бардуччи и И. Пеппи, Получение температуры и коэффициента излучения из изображений, полученных с помощью дистанционного зондирования, с использованием метода «излучения серого тела», IEEE Transactions on Geoscience and Remote Sensing, vol.34, стр 681-695, 1996.

Ф. Беккер и З. Ли, Температура поверхности и коэффициент излучения в различных масштабах: определение, измерение и связанные проблемы, Обзоры дистанционного зондирования, том 12, стр. 275-7257, 1995.

Ф. Беккер и З. Ли, Независимые от температуры спектральные индексы в тепловых инфракрасных диапазонах, Дистанционное зондирование окружающей среды, том 32, стр. 34-4257, 1990.

Ф. Беккер и З. Ли, К методу локального разделенного окна над земной поверхностью, Международный журнал дистанционного зондирования, вып.11, выпуск 3, стр 1366-5901, 1990.

А. Берк, Л. С. Бернштейн и Д. К. Робертсон, MODTRAN: модель среднего разрешения для LOWTRAN, en, tech. представитель, SPECTRAL SCIENCES INC BURLINGTON MA, 1987.

К. Берретт, Байесовская непараметрическая модель температурно-излучательной способности длинноволновых гиперспектральных изображений, Технометрика, том 56, стр. 40-1706, 2014.

Ф. Крейг, Д. Р. Борен и. Хаффман, Поглощение и рассеяние света малыми частицами, 1998.

Д.Брюне, Э. Р. Врскей и З. Ван, О математических свойствах индекса структурного подобия, том 21, стр. 1057-7149, 2012.

Дж. Дж. Буглиа, Введение в теорию переноса излучения в атмосфере, Исследования в области геофизической оптики и дистанционного зондирования, 1985.

Э. Сересо, Исследование методов рендеринга мультимедиа, Визуальный компьютер, том 21, стр. 1432-2315, 2005 г.
URL: https://hal.archives-ouvertes.fr/inria-00510151

С. Чандрасекар и Р.Передача, 1960.

Ю. М. Чанг, Исследование факторов, влияющих на инфракрасные измерения температуры в зданиях, SPIE 780. Термосенс ​​IX, стр. 11-18, 1987.

К. Ву, Сопоставление трехмерных моделей с помощью исправлений, не зависящих от точки обзора (VIP), Конференция IEEE 2008 г. по компьютерному зрению и распознаванию образов, стр. 1-8, 2008 г.

К. Ву, Поиск 3D-моделей и оценка позы на основе отдельных изображений с использованием VIP-функций, Конференция компьютерного общества IEEE по компьютерному зрению и семинарам по распознаванию образов, стр.1-8, 2008.

X. Чен, Эффект смешанных пикселей в фенологии земной поверхности: исследование с помощью моделирования, Дистанционное зондирование окружающей среды, том 211, стр. 34-4257, 2018.

Дж. Чинг, Дж. Л. Бек и К. А. Портер, Байесовское состояние и оценка параметров неопределенных динамических систем, Вероятностная инженерная механика, том 21, стр. 266-8920, 2006.

А. Александр-Адриан-Шотар, Н. Оже и. Хансен, Кумулятивная адаптация размера шага для линейных функций, 2012.

Х. Пер и.Кристенсен, Приблизительное растекание цвета по точкам, Фестиваль анимационных фильмов в Анси, стр.9, 2019.

К. Хшановски, Сравнение коротковолновых и длинноволновых измерительных тепловизионных систем, Прикладная оптика, том 34, стр.2888-2897, 1995.

К. Хшановски, Влияние условий измерения и параметров системы на точность дистанционного измерения температуры с помощью двухспектральных ИК-систем, Инфракрасная физика и технология, том 37, стр. 295-306, 1996.

М. Кларк, Д. Макканн и М.Форде, Применение инфракрасной термографии для неразрушающего контроля бетонных и каменных мостов, NDT & E International, Structural Faults and Repair, vol.36, issue 4, pp.60-69, 2003.

П. Б. Коутс, Многоволновая пирометрия, том 17, стр.103, 1981.

М. Ф. Коэн, Эффективный подход радиосигнала для синтеза реалистичных изображений, Компьютерная графика и приложения IEEE, том 6, стр. 272-1716, 1986.

Ф. Майкл, Д. П. Коэн и. Гринберг, Hemi-Cube: решение радиосвязи для сложных сред, ACM SIGGRAPH Computer Graphics, vol.19, стр 31-40, 1985.

Ф. Майкл, Дж. Р. Коэн и. Уоллес, “Радиосити и реалистичный синтез изображений”, издательство AP Professional, 1995.

М. Ф. Коэн, Подход прогрессивного уточнения к быстрой генерации изображений радиосигнала, компьютерная графика ACM SIGGRAPH, том 22, стр. 75-84, 1988.

Г. Кумб, М. Дж. Харрис и А. Ластра, Радиосити на графическом оборудовании, ACM SIGGRAPH 2005 Courses on -SIGGRAPH ’05, p.179, 2005.

Купер П. И. Поглощение излучения в солнечных штифтах, Солнечная энергия, т.12, выпуск 3, стр 333-346, 1969.

, Хранилище данных Коперника

C. Коробка-данные,

Т. М. Ковер и Дж. А. Томас, Элементы теории информации, en, Серия Wiley в телекоммуникациях, 1991.

К. Крассин, Интерактивное непрямое освещение с использованием отслеживания воксельного конуса, стр.10, 2011 г.
URL: https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-00650173

А. К. Ноэль, К. К. Кресси, и. Викл, Статистика пространственно-временных данных, Ряд Уайли в вероятности и статистике, 2011.

A. Crinière, Contribution au développement d’outils d’analyse de sequences d’images infrarouges: Application au contrôle non destructif de Structures de Génie Civil, 2014.

A. Crinière, J. Dumoulin и L. Mevel, Управление локальными мультисенсорами, применяемыми для SHM и долгосрочного инфракрасного мониторинга: реализация Cloud2IR, Quantitative In-fraRed Thermography Journal 0.0 (октябрь 2018 г.), стр. 1768- 6733

A. Crinière, Cloud2IR: Инфракрасная термография и датчики окружающей среды, интегрированные в автономную систему для долгосрочного мониторинга конструкций », en, in: European Geoscience Union EGU2016, 2016.

. Бисва-натх-датта, Численные методы для линейных систем управления: проектирование и анализ, 2004.

A. Vriendt, La Transmission de la chaleur: Introduction au rayonnement thermique, Français, vol.2

С. Дин, Применение термографических изображений неразрушающего контроля аэрокосмических конструкций, инфракрасная физика и технологии, том 97, стр. 1350-4495, 2019.

П. Делмораль, Моделирование среднего поля для интеграции Монте-Карло, Монографии по статистике и прикладной вероятности, 2013.
URL: https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-00932211

F. Derkx, Concept de Plate-forme Mobile Instrumentée (PMI) pour l’inspection des ouvrages d’art, fr, p.6

, Определение токсичности грунтовых субстратов после добычи бурого угля с использованием лабораторных тестов воспроизводства с Enchytraeus Crypticus (Oligochaeta) | SpringerLink

, Разработка статистических моделей прогнозирования температуры для тестовой дороги

К. Дрованди, Ensemble MCMC: Accelerating Pseudo-Marginal MCMC for State Space Models Using the Ensemble Kalman Filter, 2019.

Л. Дюбрей, Ю. Куинсат и К. Лартиг, Calibration Sur Modèle CAO Pour La Mesure Par Vision In-situ, 2015.

Дж. А. Даффи, В. А. Бекман, Солнечная инженерия тепловых процессов, Английский язык, 2013.

Дж. Дюмулен и В. Баучер, Инфракрасная термографическая система для исследования транспортной инфраструктуры со встроенными локальными измерениями атмосферных параметров и автономной моделью для оценки ослабления излучения, Журнал прикладного дистанционного зондирования, том 8, стр. 84978-084978, 2014.
URL: https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-01055043

Дж. Дюмулен, А. Криньер и Р. Эверти, Обнаружение и определение тепловых характеристик внутренней структуры настила моста Musmeci с помощью инфракрасного термографического мониторинга, Журнал геофизики и инженерии, том 10, выпуск 6, стр. .1742-2140, 2013.
URL: https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-01081320

П. Дутре, К. Бала и П. Бекаерт, Advanced Global Illumination, en, pp.978-979, 2006.

, Эффективное моделирование переноса света в сценах с участвующими средами с использованием фотонных карт

г.Объяснение-то и. Сэмплер, Американский статистик, том 46

С. Фокё, Инфракрасные изображения моря: анализ чувствительности и экспериментальная проверка с использованием измерений кампании MIRAMER в конфигурациях солнечного блеска, Прикладная оптика, том 52, стр. 1539-4522, 2013.

А. Мартин, Р. К. Фишлер, и. Боллс, Консенсус случайной выборки: парадигма для подгонки модели с приложениями для анализа изображений и автоматизированной картографии, Readings in Computer Vision, pp.726-740, 1987.

Дж.Гаскуэль, Быстрые нелинейные проекции с использованием графического оборудования, Труды симпозиума 2008 г. по интерактивной трехмерной графике и играм -SI3D ’08, стр.107, 2008 г.
URL: https://hal.archives-ouvertes.fr/hal- 00257806

Н. Гастинель, Линейный численный анализ, 1970.

Г. Гауссорг и С. Шомет, Инфракрасная термография, en, 1993.

У. Р. Гилкс и П. Уайлд, Адаптивная выборка отклонения для выборки Гиббса, Журнал Королевского статистического общества. Серия C (Прикладная статистика), т.41, pp.35-9254, 1992.

. Ар-гиллеспи, Теоретический базовый документ алгоритма разделения температуры и излучения, версия 2.4, en, 1999.

А. Р. Гиллеспи, Остаточные ошибки в стандартных продуктах ASTER по температуре и излучательной способности AST08 и AST05, том 115, стр. 34-4257, 2011.

К. М., Моделирование взаимодействия света между диффузными поверхностями, Труды 11-й ежегодной конференции по компьютерной графике и интерактивным методам, SIGGRAPH ’84, стр 213-222, 1984.

Н.Дж. Гордон, Д. Дж. Салмонд и А. Ф. Смит, Новый подход к нелинейному / негауссовскому байесовскому оцениванию состояния, IEE Proceedings F-Radar and Signal Processing, vol.140, pp.956-375, 1993.

С. Гортлер, М. Ф. Коэн и П. Слусаллек, Методы радиосвязи и релаксации “, en, IEEE Computer Graphics and Applications, vol.14, issue 6, pp.272-1716, 1994.

г. Cuda, -. Программирование, и. Франция,

Г. Кумб и М. Харрис, Глобальное освещение с использованием радиосигнала прогрессивного уточнения, Драгоценные камни графических процессоров: методы программирования для высокопроизводительной графики и вычислений общего назначения, т.2, стр.0-321

Э. Гринзато, В. Вавилов и Т. Кауппинен, Количественная инфракрасная термография в зданиях, энергетике и зданиях, том 29, выпуск 1, стр. 378-7788, 1998.

D. Groleau, F. Fragnaud, J. Rosant, Моделирование радиационного поведения городского квартала Марселя с помощью модели SOLENE, Proceedings ICUC-5, p.4, 2003.

К. Геймар, Простая модель для алгоритмов переноса солнечного света в атмосфере (SMARTS2) и оценка эффективности, en, 1995.

Д. К. Гамильтон, У. Р. Морган, Коэффициенты конфигурации радиантного обмена, en, 1952.

Н. Хансен, Стратегия развития CMA: сравнительный обзор, 2006 г.

Р. И. Хартли и А. Зиссерман, Многоканальная геометрия в компьютерном зрении, Second, p.521540518, 2004.

П. С. Хекберт, Текстуры с адаптивным излучением для двунаправленной трассировки лучей, Труды 17-й ежегодной конференции по компьютерной графике и интерактивным методам, SIGGRAPH ’90, стр.145-154, 1990.

Х. В. Хендерсон и С. Р. Серл, О выводе обратной суммы матриц, SIAM Review, том 23, стр. 36-1445, 1981.

А. Энон, Терморадиационное моделирование с высоким разрешением городского фрагмента в центре Марселя во время кампании UBL-ESCOMPTE, en, in: Building and Environment, vol.46, p.3601323, 2011.

, Иерархическое излучение на искривленных поверхностях | SpringerLink, том 10

Дж. Саймон и. Хук, Сравнение методов извлечения информации об излучательной способности из данных теплового инфракрасного излучения для геологических исследований, Дистанционное зондирование окружающей среды, т.42, pp.–, 1992.

Х. К. Хоттель, Передача лучистого тепла между поверхностями, разделенными непоглощающей средой, Журнал теплопередачи, стр. 265-273, 1931.

R. J. Howarth, Journel and (Ch. J.) Huijbregts. Горная геостатистика, Минералогический журнал, том 43, стр.1471-8022, 1979.

Дж. Р. Хауэлл, Р. Сигел, М. П. Пинар, Тепловой перенос тепла. 5-е, 2010.

, IASLonline NetArt: История компьютерного искусства IV.2 Компьютерная анимация

, Интегрированная система мониторинга состояния конструкций и интеллектуального управления вантовым мостом

H.Джонс и Х. Сро, Масштабирование тепловых изображений с различным пространственным разрешением: проблема смешанных пикселей, стр. 2073-4395, 2014.

Н. Кантас, О методах частиц для оценки параметров в моделях пространства состояний, Статистическая наука, том 30, стр. 883-4237, 2015.

С. Кавасима, Связь между температурой поверхности и температурой воздуха в локальном масштабе в течение зимних ночей, Журнал прикладной метеорологии, том 39, стр. 1570-1579, 2000.

А. Келлер, Instant Radiosity, Труды 24-й ежегодной конференции по компьютерной графике и интерактивным методам -SIGGRAPH ’97, стр.49-56, 1997.

А. Мансур, К. Хан, Т. В. Аллеманд, и. Игар, Бесконтактное измерение температуры. I. Методы, основанные на интерполяции, Обзор научных инструментов, том 62, стр. 34-6748, 1991.

М. Конник и Дж. Уэлш, Высокоуровневое численное моделирование шума в фотодатчиках CCD и CMOS: обзор и учебное пособие, 2014.

Дж. Крапез, Радиационные измерения температуры, тепловые измерения и обратные методы, теплопередача, OCLC: ocn587104377, 2011.

Н.Лаланн, Разработка и проверка численного инструмента для моделирования поля температуры поверхности и визуализации инфракрасного излучения в городской среде, en, in: Quantitative InfraRed Thermography Journal, vol.12, pp.2116-7176, 2015.
URL: https : //hal.archives-ouvertes.fr/hal-01111310

Б. Лейн, Неопределенность измерений температуры с помощью инфракрасной термографии для резки металлов, Metrologia 50.6 (декабрь 2013 г.), стр. 1681-7575

Б. Ласкоуп, О возможности обнаружения дефектов в композиционных материалах на основе периодического термического возбуждения, Композиты, Часть B: Техника, стр.1023-1030, 2013.
URL: https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-00845958

Дж. Лоран, Прямое сокращение света: масштабируемый подход к глобальному освещению в реальном времени, en, vol.35, p.1677055, 2016.
URL: https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-01444811

Л. Микаэль и. Bohec, Contribution Du Rayonnement Au Confort Thermique et Aux Économies d’énergie Dans l’habitat, 2017.

К. Винсент-ле, Приложения Des Réseaux de Capteurs Intelligent et de La Communication sans Fil à l’instrumentation Des Structures de Genie Civil, Bulletin des Laboratoires des Ponts et Chaussées 273, стр.9-37, 2008.

NL Touz, T. Toullier и J. Dumoulin, Инфракрасная термография, применяемая для исследования нагретых и солнечных покрытий: от численного моделирования до небольших лабораторных экспериментов, Thermosense: Thermal Infrared Applications XXXIX, vol.10214, p.1021413, 2017 .
URL: https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-01563851

С. Лефевр, С. Хорнус и Ф. Нейрет, Текстуры октодерева на графическом процессоре, Самоцветы графического процессора: методы программирования для высокопроизводительной графики и вычислений общего назначения, вып.2, pp.0-321
URL: https://hal.archives-ouvertes.fr/inria-00402118

Дж. Лехтинен, Безсеточное иерархическое представление для легкого транспорта, Транзакции ACM на графике, том 27, стр.7300301, 2008 г.
URL: https://hal.archives-ouvertes.fr/inria-00345275

Дж. Лехтинен, Безсеточные конечные элементы для иерархического глобального освещения, en, Publications in Telecommunications Software and Multimedia, p.12

F. L’entretien-du-réseau-Routier-en,

Ф.Чжао-лян-ли и. Беккер, Возможность определения температуры поверхности земли и коэффициента излучения по данным AVHRR, Дистанционное зондирование окружающей среды, том 43, стр. –, 1993.

З. Ли, Ф. Петитколин и Р. Чжан, Физически обоснованный алгоритм для определения коэффициента излучения земной поверхности на основе комбинированных данных в среднем и тепловом инфракрасном диапазоне, Science in China Series E: Technological Sciences, vol.43, pp.1862- 281, 2000.

З. Ли, Оценка шести методов извлечения спектров относительной излучательной способности из тепловых инфракрасных изображений, Дистанционное зондирование окружающей среды, т.69, pp.197-214, 1999.

З. Ли, Температура поверхности суши, полученная со спутников: текущее состояние и перспективы, Дистанционное зондирование окружающей среды 131, стр. 14–37, 2013.

З. Ли, Л. Чжао и З. Фу, Оценка суммарного радиационного потока на Тибетском плато путем ассимиляции продуктов MODIS LST с ансамблевым фильтром Калмана и фильтром частиц, в: Международный журнал прикладных наблюдений за Землей и геоинформации, том 19 , стр 303-2434, 2012.

С. Цзюнь, Р. Лю, и. Чен, Последовательные методы Монте-Карло для динамических систем, Журнал Американской статистической ассоциации, т.93, стр. 162-1459, 1998.

Г. Мачин и. Чу, Высококачественные источники черного тела для инфракрасной термометрии и термографии между -40 и 1000 ° C, The Imaging Science Journal, том 48, стр 1743-131, 2000.

Г. Масиелло, Физическое определение коэффициента излучения поверхности и температуры фильтра Калмана по геостационарному инфракрасному излучению, en, vol.6, pp.1867-8548, 2013.

А. Мбиок и Р. Вебер, Излучение в ограждениях: проблема эллиптических граничных значений, en, Scientific Computing, 2000.

Л. М. Макмиллин, Оценка температуры поверхности моря по двум измерениям через инфракрасное окно с различным поглощением, en, vol.80, pp.2156-2202, 1975.

Р. Мехри, Применение генетических фильтров для уменьшения температуры поверхности земли, en, vol.119, p.2169897, 2014.

С. К. Мердинк, Спектральная библиотека ECOSTRESS, версия 1.0, Дистанционное зондирование окружающей среды, том 230, стр. 34-4257, 2019.

М. Меттке, Nuklear: ANSI C Gui Library с одним заголовком, 2018.

В. Минкина, С. Дудзик, Имитационный анализ неопределенности пути измерения и обработки инфракрасной камерой, том 39, стр. 263-2241, 2006.

Минкина В., Дудзик С. Инфракрасная термография: ошибки и неопределенности, 2009.

М. Ф. Модест, Радиационная теплопередача, en, третье издание, OCLC: ocn813855549, 2013.

J. Monchau, Mesure d’émissivité pour la thermographie infrarouge appliquée au диагностический количественный анализ структур, 2013.

.Парри-хирам-мун, Научные основы светотехники, en, 1936.

W. Nusselt, Graphische bestimmung des winkelverhaltnisses bei der wärmestrahlung, vol.20, p.673, 1928.

Т. Омар и М. Л. Нехди, Дистанционное зондирование бетонных настилов мостов с использованием инфракрасной термографии беспилотных летательных аппаратов, Автоматизация в строительстве, том 83, стр. 360-371, 2017.

, OpenGL – отраслевой стандарт высокопроизводительной графики

R. B. Helcio и. Орланд, Тепловые измерения и обратные методы, теплопередача, OCLC: ocn587104377, 2011.

М. Паулин и Дж. Джессел, Адаптивная генерация сетки для прогрессивного излучения: алгоритм на основе трассировки лучей, en, vol.13, pp. 1467-8659, 1994.
URL: https: //hal.archives-ouvertes. fr / hal-01516279

, Температура поверхности земли, полученная с помощью усовершенствованного радиометра с очень высоким разрешением и путевого сканирующего радиометра 1

. Разрешение_радиометра_и_длинно-трековый_радиометр_1_теория,

, Зональный метод расчета интенсивности света в присутствии участвующей среды

E.Pebesma, Набор данных Meuse: Краткое руководство по пакету Gstat R, en, 2019.

М. Пеллегрини, Аппроксимация форм-факторов Монте-Карло с априорной ошибкой, дискретная и вычислительная геометрия, том 17, стр. 1432-0444, 1997.

М. Пфендер, Э. Люпферт и П. Хеллер, Пирометрические измерения температуры на солнечных тепловых высокотемпературных приемниках, Журнал инженерии солнечной энергии, том 128, выпуск 3, стр.1996231, 2006.

, Физический рендеринг: от теории к реализации

Дж.Х. Пьерлуисси, К. Э. Марагудакис и Р. Тегераномовахед, Новая модель низкотрановых полос для водяного пара, Прикладная оптика, том 28, стр. 1539-4522, 1989.

Планк М. Теория теплового излучения, Энтропия 144, т. 190, стр. 164, 1900.

В. Ци, Ф. Ли и Л. Чжэньчжун, Китайская конференция по контролю и принятию решений, стр. 3354-3358, 2010 г.

, Получение параметров атмосферы и поверхности суши из спутниковых тепловых инфракрасных гиперспектральных данных с использованием метода нейронной сети, Международный журнал дистанционного зондирования, т.34, вып.9

А. Рогальский, История инфракрасных детекторов, en, vol.20, pp.1896-3757, 2012.

О. Рустан и Ю. Девиль, Re) Dice Packages for Computer Experiments, Troisièmes rencontres R, 2014.

О. Рустант, Д. Гинсбургер и Ю. Девиль, Два пакета для анализа компьютерных экспериментов с помощью метамоделирования и оптимизации на основе кригинга, Журнал статистического программного обеспечения, том 51, 2012.
URL: https: // hal. archives-ouvertes.fr/hal-00495766

Д.Э. Сабол, Проверка в полевых условиях алгоритма разделения температурной излучательной способности ASTER, Дистанционное зондирование окружающей среды, том 113, стр. 34-4257, 2009.

Ф. Сакума и С. Хаттори, Установление практического стандарта температуры с помощью узкополосного радиационного термометра с кремниевым детектором, Кейри Кэнкджо Хкоку, стр.91-97, 1983.

П. Д. Сэмпсон, Подгонка конических сечений к «очень разрозненным» данным: итеративное уточнение алгоритма Букштейна, Компьютерная графика и обработка изображений, т.18, pp.97-108, 1982.

П. Сондерс, Общие интерполяционные уравнения для калибровки радиационных термометров, том 34, стр. 26-1394, 1997.

Б. Сеговия, Дж. К. Иел и Б. Перош, Metropolis Instant Radiosity, Форум компьютерной графики, том 26, выпуск 3, стр. 1467-8659, 2007 г.
URL: https: //hal.archives-ouvertes. fr / hal-01501494

А. Б. Шапиро, Компьютерная реализация, точность и синхронизация алгоритмов коэффициента обзора излучения, Journal of Heat Transfer, vol.107, стр 22-1481, 1985.

М. С. Шепард, Подходы к автоматическому созданию и управлению сетками из конечных элементов, Обзоры прикладной механики, том 41, выпуск 4, стр. 3-6900, 1988.

П. Ширли, Hybrid Radiosity / Monte Carlo Methods, en, p.24

П. Ширли, Сложность времени радиосвязи Монте-Карло, компьютеры и графика, том 16, выпуск 1, стр.117-120, 1992.

Д. Шрейнер, Руководство по программированию OpenGL: Официальное руководство по изучению OpenGL, 2013.

р.Шамуэй и Д. Стоффер, Временные ряды: подход к анализу данных с использованием R, английский, стр.978-978, 2019.

X. François and. Силлион, Унифицированный иерархический алгоритм глобального освещения с рассеивающими объемами и кластерами объектов, IEEE Transactions по визуализации и компьютерной графике, том 1, выпуск 3, 1995.

X. François, C. Sillion, and. Пуэч, Общий двухпроходный метод интегрирования зеркального и диффузного отражения, Proceedings of SIGGRAPH ’89, pp.335-344, 1989.

Х.Франсуа, К. Силлион и. Пуэч, Радиосити и глобальное освещение, том 11, 1994.

X. François and. Силлион, Решение глобального освещения для общих распределений отражения, Материалы конференции SIGGRAPH’91, стр.187-196, 1991.

, SMARTS: Простая модель переноса солнечного света в атмосфере | Модернизация сети | NREL

W. C. Снайдер, Коэффициент излучения на основе классификации для измерения температуры поверхности Земли из космоса, Международный журнал дистанционного зондирования, вып.19, стр 1366-5901, 1998.

Дж. А. Собрино, Улучшения в методе разделения окна для определения температуры поверхности земли, IEEE Transactions по геонауке и дистанционному зондированию, том 32, выпуск 2, стр.1962892, 1994.

Дж. Собрино, Многоканальные и многоугловые алгоритмы оценки температуры поверхности моря и суши с помощью данных ATSR, Международный журнал дистанционного зондирования, том 17, стр. 2089-2114, 1996.

Г. Сориа и Дж. А. Собрино, Температура поверхности земли, полученная ENVISAT / AATSR над неоднородной областью, Дистанционное зондирование окружающей среды, т.111, стр 34-4257, 2007.

Э. М. Спарроу, Р. Д. Сесс, Радиационная теплопередача, en, 1978.

, Оценка пространственно-временного поля с использованием фильтра Кригеда Калмана (KKF) с размещением датчика, обеспечивающим разреженность

Дж. У. Спенсер, Представление положения Солнца рядами Фурье, стр.172, 1971.

М. Л. Стейн, Интерполяция пространственных данных: некоторая теория кригинга, en, Springer Series in Statistics, pp.978-978, 1999.

И. Э. Сазерленд, Трехмерный ввод данных с помощью планшета, Труды IEEE, vol.62, стр 18-9219, 1974.

, Flir Systems, Полное руководство по инфракрасным технологиям для профессионалов в области исследований и разработок

Р. Теннисон, Структурный мониторинг состояния инновационных мостов в Канаде с помощью оптоволоконных датчиков, интеллектуальных материалов и конструкций 10, стр. 560, 2001.

, Применение искусственных нейронных сетей для анализа данных дистанционного зондирования: Международный журнал дистанционного зондирования, том 29

, официальный веб-сайт YAML

Т. Тулье, Ж. Дюмулен, В.Буржуа, Сравнительное исследование предварительного обнаружения горячих ящиков движущихся поездов и подсчета осей путем внедрения двух инфракрасных камер на месте, Конференция по количественной инфракрасной термографии QIRT Asia 2019, 2019.
URL: https://hal.archives-ouvertes.fr / hal-02264672

Н. Л. Туз, Концепция и инфраструктура транспорта с позитивной энергией: термомеханическая модификация с оптимизацией энергетических систем, 2018.

М. П. Утриллас, Сравнительное исследование параметризованных моделей SPCTRAL2 и SMARTS2 на основе измерений спектральной освещенности в Валенсии, Испания, Solar Energy, vol.63, стр 161-171, 1998.

Х. К. Ван-де-Хюльст, Рассеяние света малыми частицами, 1957.

С. Ван-де и. Виджвер, Влияние параметров окружающей среды на термографический анализ ограждающих конструкций здания, 12-я Международная конференция по количественной инфракрасной термографии, 2014 г.

К. Ведель и К. Пуэх, Стенд для тестирования адаптивного подразделения в прогрессивной радиосити, Второй семинар Еврографики по рендерингу, 1991.

С. Венафра, ПОЛУЧЕНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ ПОВЕРХНОСТИ И ИЗЛУЧЕНИЯ ИЗ ДАННЫХ СЕВИРИ: ВНЕДРЕНИЕ МЕТОДОЛОГИИ ФИЛЬТРА KALMAN ДЛЯ ПОЛНОГО ДИСКА И ПРОВЕРКА С НАБЛЮДЕНИЯМИ НА МЕСТЕ, 2015.

Дж. Р. Уоллес, М. Ф. Коэн и Д. П. Гринберг, Двухпроходное решение уравнения визуализации: синтез методов трассировки лучей и излучения, Труды 14-го

, Ежегодная конференция по компьютерной графике и интерактивным методам, SIGGRAPH ’87, стр. 311-320, 1987.

Г. Валлнер, Решатель радиосити с расширенным графическим процессором: включая диффузное и зеркальное отражение и передачу, Визуальный компьютер, том 25, стр. 1432-2315, 2009.

Б. Уолтер, Lightcut: масштабируемый подход к освещению, ACM SIGGRAPH 2005, стр.10, 2005.

Х. Ван, Изготовление матрицы микроболометров на интегральной схеме непланарного считывания, Международный журнал инфракрасных и миллиметровых волн, том 26, стр. 1572-9559, 2005.

Т. Уиттед, Улучшенная модель освещения для затемненного дисплея, Commun. ACM, том 23, выпуск 6, стр 343-349, 1980.

O. Wiki, Обзор конвейера рендеринга – OpenGL Wiki, 2019.

К. Кристофер, Н. Викл, и. Кресси, Подход с уменьшением размерности к пространственно-временной фильтрации Калмана, 1999.

Дж. Йон, 320 x 240 неохлаждаемый IRFPA с вакуумной упаковкой для тонкой пленки Pixel Wise, Международное общество оптики и фотоники, том 8541, стр. 85410, 2012.

М. Згал, Л. Мевел и П. Д. Мораль, Оценка модальных параметров с использованием взаимодействующего фильтра Калмана, Механические системы и обработка сигналов, том 47, стр. 139-150, 2014 г.
URL: https: //hal.archives- ouvertes.fr/hal-00824108

?. T. Toullier, J. Dumoulin и L. Mevel, Количественный анализ систематической ошибки измерений из-за экологической и пространственной дискретизации при долгосрочном тепловом мониторинге конструкций с использованием наружной инфракрасной термографии, Quantitative Infrared Thermography (QRT) Journal, 2019.

Т. Тулье, Ж. Дюмулен,;. Тулье, Ж. Дюмулен и Л. Мевел, Сравнительное исследование предварительного обнаружения горячих ящиков движущихся поездов и подсчета осей с помощью двух инфракрасных камер на месте, Publication dans des conférences internationales avec acte et comité de lecture?, Стр. -27, 2019.
URL: https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-02264672

?. T. Toullier, J. Dumoulin и L. Mevel, Изучение систематической ошибки измерений из-за окружающей среды и пространственной дискретизации при долгосрочном тепловом мониторинге конструкций с помощью инфракрасной термографии, с.14
URL: https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-018

, Конференция по количественной инфракрасной термографии, 2018.

?. T. Toullier, J. Dumoulin и L. Mevel, Сравнение измерений поверхности термопарами и инфракрасной термографии для теплового мониторинга транспортной инфраструктуры, 14-й международный семинар по передовым инфракрасным технологиям и приложениям, AITA 2017, 2017.
URL: https: // hal .archives-ouvertes.fr / hal-02139133

?. Н. Ле-Тоуз, Т.Тулье и Ж. Дюмулен, Применение инфракрасной термографии для исследования нагретых и солнечных покрытий: от численного моделирования до небольших лабораторных экспериментов, Conférence Thermosense XXXIX, 2017.
URL: https://hal.archives-ouvertes.fr/hal -01563851

, Communications dans des conférences internationales avec acte

?. T. Toullier, J. Dumoulin и L. Mevel, Чувствительность различных методов для одновременной оценки излучательной способности и температуры посредством моделирования многоспектральной инфракрасной термографии, Инновационные приборы, методы, геофизические методы и модели для приповерхностной геофизики, городов и транспортных инфраструктур, 2019 .
URL: https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-02264677

?. T. Toullier, J. Dumoulin и L. Mevel, Инновационные приборы, методы, геофизические методы и модели для приповерхностной геофизики, городов и транспортных инфраструктур, 2018.

Т. Тулье, Ж. Дюмулен и Л. Мевель, Исследование и развитие моделирования в трехмерных изображениях и динамических наблюдениях за инфракрасной термографией, стр. 27

?. Т. Тулье, Ж. Дюмулен, Л.Mevel, Étude de sensibilité de différentes méthodes de séparation for lévaluation simultanée de lémissivité et de la température par thermography multisppectrale, 26ème Conférence de la Société Française de Thermique, 2018.

?. T. Toullier, J. Dumoulin и L. Mevel, Этюд по сравнительному анализу двух подходов, интегрированные термопары и инфракрасная термография, для наблюдения за термической инфраструктурой дюн на транспорте, 2017.

,? Doctoriales du Département Cosys de l’IFSTTAR, présentation des travaux réalisés à ce jour, стр.