Термотаблетка убл: Ремонт стиральных машин LG в Симферополе. Часть 3 – замена УБЛ (замка), замена заливного клапана (КЭН), замена нагревателя (ТЭНа), замена помпы. – Стиральные машины – Каталог статей – Мастеркрым +7(978)0731995

Опубликовано автором

Содержание

Ремонт стиральных машин LG в Симферополе. Часть 3 – замена УБЛ (замка), замена заливного клапана (КЭН), замена нагревателя (ТЭНа), замена помпы. – Стиральные машины – Каталог статей – Мастеркрым +7(978)0731995

1.Замок, устройство блокировки люка или сокращённо УБЛ

         Дефектация, проверка работоспособности и замена этого функционального узла, стоит первой в списке не с проста. Дело собственно вот в чём:

  1. При включении стиральной машины в сеть, общая клема УБЛ подключается к линии питания (L), ровно как и одна из клем реле ТЭНа (HTR_TL). Нейтральный (N) провод сетевого питания при этом, подключен к одному из выводов реле питания, однако сам электронный модуль ещё не запитан, так как линия N не поступает на модуль через разомкнутые контакты реле PWR_REL.
  2. Когда пользователь нажимает кнопку “питания”(SB1), линия N поступает на электронный модуль через R1 и SB1.
  3. Запитанный электронный модуль подаёт питание на силовое реле, которое замыкается, и шунтирует пусковую цепь R1SB1, обеспечивая штатное питание электронного модуля.
  4. После загрузки белья, с соответствующим выбором программы стирки, и последующим закрытием загрузочного люка, нажимается кнопка старт, первым из узлов стиральной машины, начинает свою работу замок – по команде с электронного блока управления (ЭБУ), через реле DL_RL, линия N подключается к свободному выводу термотаблетки, при этом второй вывод уже подключен к линии L, т.е. термотаблетка подключена к сетевому напряжению. Замок срабатывает, происходит блокировка загрузочного люка, при выполнении которой замыкаются силовые контакты УБЛ, тем самым подавая питание на большую часть схемы стиральной машины (СМ).
  5. Микроконтроллер, определив наличие сигнала о закрытии двери (door lock) начинает выполнение заданной программы стирки.

С работой СМ, в части работы УБЛ, разобрались. Разберём детальней работу самого замка, в чем нам поможет следующая иллюстрация:

       Замки в стиральных машинах LG, чаще всего чаще всего применяются термо-механического типа, т.

е. в них установлен позистор (фактически терморезистор с положительным температурным коэффициентом сопротивления, что означает увеличение сопротивления с ростом температуры), при подаче напряжения на который происходит его нагрев и с повышением температуры нагрев прекращается. Этот самый позистор имеет тепловой контакт с биметаллической пластиной, которая нагревшись выгибается, и замыкает электрическую цепи силовых контактов УБЛ, с одновременным механическим блокированием крючка дверцы СМ, дабы не допустить её открытия во время работы.

     Как видно из схемы, фазная линия подключена к УБЛ постоянно, пока стиральная машина включена в сеть. А вот нейтраль к термотаблетке, подключается через реле замка, расположенное в электронном модуле, управляемое, через транзисторный ключ, с микроконтроллера системы управления.

Рассмотрим основные неисправности замка стиральной машины (УБЛ)
  1.     Отсутствие реакции на подачу управляющего напряжения, стиральная машина не начинает стирку, отображает код ошибки DE. Чаще всего подобная неисправность вызвана разрушением термотаблетки внутри УБЛ из за её разрушения либо обгорания электрических контактов, через которые на неё подаётся напряжение. Реже причиной является обугливание силовых контактов.        В первом случае сопротивление термотаблетки стремится к бесконечности, во втором к той же величине стремится сопротивление силовых контактов.
  2.      УБЛ не снимает блокировку двери по окончании стирки, управляющее напряжение на замок не подаётся, СМ отображает что дверь закрыта. Такое поведение СМ говорит о “залипании” контактов силовой группы. Что не даёт разблокировать крючок двери.
  3.     УБЛ не снимает блокировку двери по окончании стирки, управляющее напряжение на замок не подаётся, СМ отображает что дверь
    открыта    . Такое поведение СМ говорит о том что произошло заклинивание механической части УБЛ. При этом за частую требуется грубое вскрытие замка.
  4.   Стиральная машина не начинает стирку, наблюдается резкий запах гари. Зачастую так проявляется выгорание клем УБЛ. При этом, помимо замены замка, необходимо заменить и клемы.

Как проверить замок (УБЛ) стиральной машины LG.

Оптимальный способ проверки текущей работоспособности замка, без оценки степени его работоспособности, заключается в следующем:

  • подаем, при помощи вилки с клемами типа “мама”, сетевое напряжение на контакты термотаблетки – выводы 1 и 2 замка.
  • сдвигаем механический блокиратор крючка в сторону защёлки, что при исправном замке должно привести к её попаданию в окошко тяги.
  • быстро отключаем питание от замка, и тестером меряем наличие контакта на клемах силовой группы группы УБЛ, контакты 2 и 3 замка. Если они замкнулись, значит УБЛ исправен.

Замена замка (УБЛ) стиральной машины LG

   Для замены УБЛ оптимальным будет использование оригинальных замков для стиральных машин LG, которые всегда имеются в продаже в нашем магазине. Код детали 6601ER1005A, наш внутренний код – 02. 10395 Однако при отсутствии такового, можно использовать замки от других стиральных машин, главное чтобы соответствовали установочные размеры. Следует учитывать, что назначение контактов замка при этом может не соответствовать исходному. Поэтому придётся тестером сначала определить к каким выводам подключен терморезистор, затем подать на него питание, после чего отключить и замерить какие выводы замкнулись.

   До тех пор пока не сработала защёлка, неправильное подключение сетевого напряжения не приводит к последствиям, однако после её срабатывания можно устроить короткое замыкание, со всеми вытекающими последствиями.

Будьте предельно осторожны при работе с высоким напряжением, и не допускайте таких работ если не имеете соответствующеё квалификации – это реально опасно для жизни!

<-Часть 2 Часть 3 Часть 4->

Как проверить и провести замену замка люка (УБЛ) стиральной машины. Статьи компании «©ZiP-Pro»

Современные автоматические стиральные машины достаточно сложное устройство и в целях безопасности в них предусмотрены определенные системы, которые призваны защитить пользователей от неприятных ситуаций.  Например, дверца стиралки на период выполнения цикла запирается специальным устройством — УБЛ (устройство блокировки люка). Он подает сигнал модулю управления о том, что люк закрыт и блокирует его, не давая открыть во время стирки. Если соответствующий сигнал не прошел, стирка не начнется!

Как и любой другой механизм, замок может выйти из строя. Причин неисправностей отметить можно немного, проверить самостоятельно несложно, так что рассмотрим варианты самостоятельной проверки.

 

Принцип работы и виды блокировки

Перед тем, как приступить к проверке устройства, нужно понять, как оно работает. В современных машинах используется два основных типа замка: 

Электромагнитный.  Минус этого замка в том, что он работает, до тех пор пока есть электричество. Если его внезапно отключат, у вас не получится открыть люк.

Биметаллический. Устройство и принцип работы такого замка очень просты и надежны: во время начала цикла стирки на термический элемент подается электричество, отчего он нагревается. Элемент нагревает биметаллические пластины, они выгибаются и оказывают давление на запорный рычаг, который и закрывает дверцу.

     

 

Термозамки с биметаллическими пластинами являются более надежными и производители стиральных машин все чаще используют их в при производстве.

 

Цикл стирки закончен, но люк некоторое время не открывается. Такая задержка предусмотрена для безопасности, чтобы движущиеся части полностью остановились, вода слилась. 

 

Самое важное преимущество термозамков: даже без электричества их можно открыть.

 

Почему УБЛ выходит из строя 

Почему же замок ломается? Вот основные причины неисправности:

  • Продолжительное использование способствует износу биметаллических пластин. Из-за постоянной деформации пластины утрачивают свои функциональные свойства.
  • Нередко замок выходит из строя при причине короткого замыкания.

 

Пока на устройство подается напряжение, оно работает.

Поэтому, если ваша стиралка остановилась, но дверь не разблокировалась, не спешите винить устройство блокировки. Скорее всего, сломался симистор на электронной плате, который отвечает за работу УБЛ. Питание подается беспрерывно, поэтому дверца не открывается. 

 

 

 

Самостоятельная проверка замка СМА 

  • машина отключена, однако люк остается закрытым. Причина может быть как в устройстве блокировки, так и в главном модуле.
  • При запуске цикла стирка не начинается, люк остается открытым.
  • Машина выдает код неисправности, означающий неисправность замка. 

Чтобы определить, сломан замок или что-то другое, нужно знать, как проверить устройство тестером. 

Вам нужно демонтировать УБЛ с машины:

  • отключите СМА от сети
  • откройте дверцу
  • отогните манжету люка и снимите ее хомут. 

     

  • вы увидите замок, оттянув манжету сбоку 

  • открутите два болта, которыми крепится замок

     

  • Разожмите все разъемы и достаньте блокиратор.  

  

Теперь, когда УБЛ у вас в руках, вы можете начать проверку замка стиральной машины. Чтобы воспользоваться мультиметром, понадобится схема замка. Это необходимо для определения расположения общего и нейтрального контактов. 

 

В домашних условиях вы сможете проверить только термоэлемент, который нагревает пластины.

  • Установите тестер в режим измерения сопротивления.
  • Приложите его щупы к нейтральному и фазовому контакту 

 

  1. Замок исправен, если на экране показалось трехзначное число.
  2. Щупальца мультиметра переставьте на контакты нейтральный – общий.
  3. Устройство неисправно, если на табло высветилось 1 или 0. 

 

Выяснив, работоспособно устройство блокировки люка в вашей стиральной машине или нет, вам нужно установить замок на место (неважно новый или тот, который сняли). При сборке порядок действий будет обратный:

  • подключите провода к исправному устройству
  • заведите его за стенку корпуса, установите в отверстие для замка
  • закрутите винты крепления
  • установите на место хомут манжеты

Проверка УБЛ в стиральной машине задача не сложная, вы сможете сделать это своими руками.  

Установить новый замок люка при необходимости не составит труда новичку, главное – последовательность действий. 

 

УБЛ. Блокировки (замки) люка стиральных машин

Блокировка (замок) люка стиральной машины MetalFlex ZV-446

Универсальная. 3 контакта. Аналоги: 085194*, `AR4426, WF250, 08me01

Артикул:  INT005AR

Производитель: MetalFlex (Италия) Для стиральных машин: Indesit / Ariston Маркировка на корпусе: E1 16001575905

490 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины MetalFlex ZV-446T

Универсальная. 3 контакта. Аналоги: 2805310100, 2805310400, INT001AC

Артикул:  b2805311400

Производитель: MetalFlex (Италия) Для стиральных машин: Beko / Samsung Маркировка на корпусе: T 28053114 00

950 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины MetalFlex ZV-446T3

Универсальная. 3 контакта. Аналоги: 2805310800, AC4410, INT007AC *

Артикул:  2805311600

Производитель: MetalFlex (Италия) Для стиральных машин: Beko / Samsung Маркировка на корпусе: T3 2805311600

750 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины MetalFlex ZV-446L

Универсальная. 3 контакта. Аналоги: DC64-00653A, WF249, SU4401, INT000SA*

Артикул:  DC64-00653C

Производитель: MetalFlex (Италия) Для стиральных машин: Beko / Samsung Маркировка на корпусе: DC64-00653C

690 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины MetalFlex ZV-446L5

Универсальная. 3 контакта. Аналоги: INT003SA*

Артикул:  DC64-01538A

Производитель: MetalFlex (Италия) Для стиральных машин: Beko / Samsung Маркировка на корпусе: DC64-01538A

690 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины MetalFlex ZV-446h2

Универсальная. 3 контакта. Аналоги: WF246, `AD4423, 68AK004, 651016770

Артикул:  INT001AD

Производитель: MetalFlex (Италия) Для стиральных машин: Ardo Маркировка на корпусе: h2

700 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины MetalFlex ZV-446D1

Универсальная. 3 контакта. Аналоги: 283993, 297327

Артикул:  306612

Производитель: MetalFlex (Италия) Для стиральных машин: Indesit / Ariston Маркировка на корпусе: D1

1450 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины MetalFlex ZV-446A4

Универсальная. 3 контакта. Аналоги: 481288818111, 481288818086, 481288818084, 481288818418, 481288818013, 32005174, INT000VE*

Артикул:  30023290

Производитель: MetalFlex (Италия) Для стиральных машин: Vestel / Whirlpool / Bauknecht Маркировка на корпусе: A4

750 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины MetalFlex ZV-446M4

Универсальная. Используется в стиральных машинах ARISTON, CREDA, GENERAL ELECTRIC, HOTPOINT. 3 контакта. Аналоги: 1603292, 199946, INT001HP*

Артикул:  1604781

Производитель: MetalFlex (Италия) Для стиральных машин: Hotpoint \ Ariston Маркировка на корпусе: M4

800 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины MetalFlex ZV-449

Универсальная. 3 контакта. Под защелки. Аналоги: 309745

Артикул:  ZV449

Производитель: MetalFlex (Италия) Для стиральных машин: Indesit / Ariston Маркировка на корпусе: E2-01 160030399.00

750 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Rold DA 081043

Универсальная. 3 контакта. Аналоги: WF248, 08LG00, LG4400, 6601ER1005C(E,B)

Артикул:  INT000LG

Производитель: Rold (Италия) Для стиральных машин: LG Маркировка на корпусе: DA081043, 64265144

700 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Rold DA 081045

Универсальная. 3 контакта. Аналоги: 6601ER1005B, WF245, LG4401, INT001LG*

Артикул:  DA081045

Производитель: Rold (Италия) Для стиральных машин: LG Маркировка на корпусе: DA081045, 69230005B, 7020404

800 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Rold DM066 297327

Универсальная. 3 контакта. На защелках. Type: DM066. Аналоги: 306612, 309811, INT008ID, WF255

Артикул:  297327

Производитель: Rold (Италия) Для стиральных машин: Indesit / Ariston Маркировка на корпусе: DM066, 16 68797

700 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины MetalFlex ZV-445T

Универсальная. 3 контакта. Аналоги: DC61-20205B, DC61-00122A, b2601440000

Артикул:  INT000AC

Производитель: MetalFlex (Италия) Для стиральных машин: Beko / Samsung Маркировка на корпусе: Model T

950 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Bitron 482000022732

Универсальная. 3 контакта. Type: DL-LC. Аналоги: 085194, INT008AR*

Артикул:  482000022732

Производитель: Bitron (Италия) Для стиральных машин: Indesit / Ariston

750 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Bitron 011140

Универсальная. 3 контакта. Type: 626. Аналоги: INT001AR*, 68AR013, 1.42.012.17

Артикул:  011140

Производитель: Bitron (Италия) Для стиральных машин: Indesit / Ariston Маркировка на корпусе: tipo 626

800 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Rold DA 057714

Универсальная. 4 контакта. Аналоги: INT003AC, AC4403*

Артикул:  b2704830300

Производитель: Rold (Италия) Для стиральных машин: Beko / Samsung Маркировка на корпусе: DA 057714, 3690430, 2704830300

900 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины CONCORE

Универсальная. 3 контакта. Для машин LG Direct Drive Inverter. Аналоги: 6601ER1005, 6601EN1003A, 6601EN1003B, 6601ER1005E, LG4403*

Артикул:  6601EN1003D

Производитель: Concore (Италия) Для стиральных машин: LG Маркировка на корпусе: 1612234661С1

750 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Rold DS 88/T3 57601

Блокировка люка для стиральных машин с вертикальной загрузкой. 3 контакта. Аналоги: 029595, 530000202, 481927138287, 481981729455, 482227138287, 651016750, 530000200, 530000201, INT004AD *

Артикул:  57601

Производитель: Rold (Италия) Для стиральных машин: Ardo Маркировка на корпусе: DS 88/T3, 57601, 7110409

1050 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Rold DS 88/T4 57674

Блокировка люка для стиральных машин с вертикальной загрузкой. 3 контакта. Аналоги: 051478, INT002AR *

Артикул:  57674

Производитель: Rold (Италия) Для стиральных машин: Brandt Маркировка на корпусе: SERIES DS 88/T4, 57674

1800 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Bitron 124967514

Универсальная. 4 контакта. Type: DL-S1. Аналоги: 1249675131, 1249675149, 3792030425, ZN4425, 68ZN011

Артикул:  INT010ZN

Производитель: Bitron (Италия) Для стиральных машин: Electrolux / AEG / Zanussi Маркировка на корпусе: 124967514

1000 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Bitron 1240349017

Универсальная. 3 контакта. Type: BP P/5-R. Аналоги: 1240349009, 1240749000, 50222729001, 50226735004, 50232848007, 481927618416, 8996454261208, INT004ZN*

Артикул:  1240349017

Производитель: Bitron (Италия) Для стиральных машин: Electrolux / AEG / Zanussi Маркировка на корпусе: 12403490/1

1200 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Bosch 056762

Универсальная. 4 контакта. Аналоги: 0056762, 68BS953, WF237, 1.42.003.02

Артикул:  INT004BO

Производитель: NoName Для стиральных машин: BOSCH / SIEMENS / NEFF Маркировка на корпусе: 16495.0.000, 3063015 AA 3

1400 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Rold DA 000021

Универсальная. 3 контакта. Аналоги: Bosch-00069639, ROLD DA000021, 0926005

Артикул:  INT003BO

Производитель: Rold (Италия) Для стиральных машин: BOSCH / SIEMENS / NEFF Маркировка на корпусе: DA000021, 61869097

900 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины MetalFlex ZV-445h2

Универсальная. 3 контакта. Для стиральных машин: ARDO, Вятка, MERLONI, HOOVER. Аналоги: 530000100, 651050392, 998020800, INT000AD*

Артикул:  530000102

Производитель: MetalFlex (Италия) Для стиральных машин: Ardo Маркировка на корпусе: Model h2

970 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Rold DA 658976

Универсальная. 3 контакта. Под защелки. Аналоги: INT004BY, Bo4414, 658976, 421470, DA003561 *

Артикул:  658976

Производитель: Rold (Италия) Для стиральных машин: BOSCH / SIEMENS / NEFF

1000 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Rold DA 003561

Универсальная. 3 контакта. Под защелки. Аналоги: 603514, 423587, Bo4414, 658976, 421470

Артикул:  INT004BY

Производитель: Rold (Италия) Для стиральных машин: BOSCH / SIEMENS / NEFF Маркировка на корпусе: DA003561, 59675344

1000 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Rold DF 01

Универсальная. Электромагнитная. 4 контакта. Аналоги: EBF49827805, 6601ER1004D, AGF69478145, WM2021szw

Артикул:  EBF49827803

Производитель: Rold (Италия) Для стиральных машин: LG Маркировка на корпусе: DF, 67982 45 F01 Q

1080 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Rold DA 076665

Универсальная. 3 контакта. Аналоги: C00111494

Артикул:  111494

Производитель: Rold (Италия) Для стиральных машин: Indesit / Ariston Маркировка на корпусе: DA076 665, 65033190

1400 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Rold DS 88

Универсальная. 3 контакта. Аналоги: 57711, 046500, 051438, INT001BO

Артикул:  051438

Производитель: Rold (Италия) Для стиральных машин: Indesit / Ariston Маркировка на корпусе: DS 88, 57711, 57038

1400 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины EMZ Type 881

Универсальная. 3 контакта. Аналоги: WD12h520, INT008BO, 00619468, 00621550

Артикул:  621550un

Производитель: EMZ (Германия) Для стиральных машин: BOSCH / SIEMENS / NEFF Маркировка на корпусе: EG-380710, 9000735664

1270 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Bitron 254755

Серая рамка, без внутреннего микровключателя. Универсальная. 3 контакта. Type: DL-S2 (новая версия). Аналоги: 285597, INT007ID

Артикул:  254755

Производитель: Bitron (Италия) Для стиральных машин: Indesit / Ariston Маркировка на корпусе: tipe DL-S2, 160026094.01

1300 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Bitron 294848

Черная рамка, с внутренним микровключателем. Универсальная. 3 контакта. Type: DL-S2 (новая версия).

Артикул:  294848

Производитель: Bitron (Италия) Для стиральных машин: Indesit / Ariston Маркировка на корпусе: tipe DL-S2, 160026579.00

1600 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Bitron 307442

Универсальная. 3 контакта. Type: DL-LC2. Аналоги: 482000032280

Артикул:  307442

Производитель: Bitron (Италия) Для стиральных машин: Indesit / Ariston Маркировка на корпусе: tipe DL-LC2, 160026578.00

1150 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Bitron EBF61315801

Универсальная. Для стиральных машин LG Direct Drive Inverter. 4 контакта. Type: DL-S2. Аналоги: INT008LG, WM20127w

Артикул:  EBF61315801

Производитель: Bitron (Италия) Для стиральных машин: LG Маркировка на корпусе: tipe DL-S2

1200 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Bitron 1461174045

Универсальная. 4 контакта. Type: DL-S1. Аналоги: 1461174037, 1461174003, 1461174029, INT015ZN *

Артикул:  146117411

Производитель: Bitron (Италия) Для стиральных машин: Electrolux / AEG / Zanussi Маркировка на корпусе: 146117411

1400 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Rold DK 001

Универсальная. 3 контакта. Аналоги: 264161, 36400057, DKS01870

Артикул:  299278

Производитель: Rold (Италия) Для стиральных машин: Indesit / Ariston Маркировка на корпусе: DK001, 62441 89 9324

1550 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Samsung DC64-00120E

Универсальная. 4 контакта. Мгновенного действия с рычагом для троса аварийного открывания люка. Аналоги: DC61-00115A

Артикул:  INT002SA

Производитель: Dae Han Nakagawa (Корея) Для стиральных машин: Beko / Samsung Маркировка на корпусе: DD-S22E, 6429 D

1550 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины MetalFlex ZV-445P5

Универсальная. 3 контакта. Для стиральных машин: ARISTON, INDESIT, ARDO и др. Аналоги: 011140, 53000102, INT000AR*

Артикул:  ZV-445P5

Производитель: MetalFlex (Италия) Для стиральных машин: Indesit / Ariston Маркировка на корпусе: Model P5

1100 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Rold DA 066042

Универсальная. 3 контакта. Аналоги: 085194, 115517, 201248, INT006AR*

Артикул:  DA066042

Производитель: Rold (Италия) Для стиральных машин: Indesit / Ariston Маркировка на корпусе: 066042, DA066, 68760364

550 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Rold DA 056513

Универсальная. 3 контакта. Аналоги: DA065510, 50220807007, 50226738008, 485170610001, 1240348001, INT001ZN*

Артикул:  DA056513

Производитель: Rold (Италия) Для стиральных машин: Electrolux / AEG / Zanussi Маркировка на корпусе: DA 056513, 132100903, DA056

800 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Rold DA 003733

Универсальная. 3 контакта. Аналоги: 2704830100, AC4400, INT002AC*

Артикул:  DA003733

Производитель: Rold (Италия) Для стиральных машин: Beko / Samsung Маркировка на корпусе: DA003, 65629203, 2704830100, DA 003733

900 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Rold DM 053557

Универсальная. 3 контакта. Аналоги: 91201208, 41041367, 41016879, INT001CY, 49030389*

Артикул:  DM053557

Производитель: Rold (Италия) Для стиральных машин: Candy Маркировка на корпусе: DM053, 053557, 7494232, 41041367

700 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Rold BP 92129592

Универсальная. 2 контакта. Для стиральных машин: Candy, Hoover, Zerowatt и др. Аналоги: 91201634

Артикул:  92129592

Производитель: Rold (Италия) Для стиральных машин: Candy Маркировка на корпусе: serie BP, GIAS 92129592

700 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Rold DA 266241

Универсальная. 5 контактов. Аналоги: 091911, INT010ID*

Артикул:  DA266241

Производитель: Rold (Италия) Для стиральных машин: Indesit / Ariston Маркировка на корпусе: DA266241, DA266, 85677179A

1000 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Rold DA 058028

Универсальная. 3 контакта. Аналоги: 8010469, DA060028, INT002ZN*

Артикул:  DA058028

Производитель: Rold (Италия) Для стиральных машин: Польского производства Маркировка на корпусе: DA058028, DA058, 71370058

900 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Rold DA 077050

Универсальная. 3 контакта. Аналоги: 170966 *, DA077

Артикул:  DA077050

Производитель: Rold (Италия) Для стиральных машин: Gorenje Маркировка на корпусе: DA077050, DA077, 90565042, 170966

700 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Rold DM 569517

Универсальная. 3 контакта под фишку. Аналоги: 481075043881, 461971428361, DM569517

Артикул:  311179

Производитель: Rold (Италия) Для стиральных машин: Vestel / Whirlpool / Bauknecht Маркировка на корпусе: DM569517, DM569, 461971428361

1750 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Rold DA 045671

Универсальная. 3 контакта. Аналоги: 1462229202,1084765104

Артикул:  146222922

Производитель: Rold (Италия) Для стиральных машин: Electrolux / AEG / Zanussi Маркировка на корпусе: DA045, 63767148, 146222922, DA045671

1300 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Rold DF 272452

Универсальная. 3 контакта. Аналоги: INT014ID *

Артикул:  272452

Производитель: Rold (Италия) Для стиральных машин: Indesit / Ariston Маркировка на корпусе: DF series

1450 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Rold DKS 08624

Универсальная. 3 контакта под фишку. Аналоги: 510057, 488000510057, 488000536021

Артикул:  536021

Производитель: Rold (Италия) Для стиральных машин: Indesit / Ariston Маркировка на корпусе: DKS08, DKS08624, W11114342, 160033664 Вес: 0.055кг

1700 Руб

Блокировка (замок) люка стиральной машины Arylux B20A2M11

Универсальная. 3 контакта. Аналоги: 530000100, AD4409, B20A3, 1.42.012.04, WF240, INT002AD *

Артикул:  530000106

Производитель: Arylux S.p.A. Для стиральных машин: Ardo Маркировка на корпусе: B20A3

900 Руб

что такое перчатки из нитрила flexal pdf free

Партнер по сотрудничеству

Перчатки из полимерных материалов что это? – О …- что такое перчатки из нитрила flexal pdf free ,Перчатки из полимерных материалов что это? Содержание 1 Какие перчатки лучше: нитриловые, виниловые или латексныечто такое нитриловые перчаткиПерчатки нитриловые – ФлексоГрупп. Заказать Перчатки нитриловые или другие товары из раздела Перчатки с доставкой по Минску и Беларуси можно в магазине компании ФлексоГрупп … что это такое, и …

Автомобильные перчатки для мужчин: Купить мужские перчатки …

Содержание фотоподборка и советы по выборуМужские автомобильные …

Перчатки нитриловые или латексные что лучше – Эксперт по …

Перчатки нитриловые или латексные что лучше Перчатки Долгое время у медиков и мастеров красоты были в распоряжении только латексные одноразовые перчатки из натурального каучука.

Перчатки нитриловые неопудренные. Используемые в …

Перчатки медицинского назначения из нитрила, сырьём для изготовления которых служит синтетический каучук, являются средством индивидуальной защиты (СИЗ) персонала.

Нитриловые перчатки – что это такое?

Как выбрать нитриловые медицинские перчатки, каких бывают виды и их стоимость. На что обратить внимание при покупке подобных перчаток. Читайте дальше.

Перчатки 9 мил гавани для продажи

Alibaba предлагает перчатки с логотипом печати, 50882 видов. Примерно 6% из них составляют боксерские перчатки, 2% — защитные перчатки, 1% — хозяйственные перчатки.

Нитриловые перчатки: что это такое | Новости России сегодня

Aug 10, 2021·Нитриловые перчатки: что это такое. автор: … В медицинских задачах лучше использовать перчатки из нитрила без опудривания пшеничным крахмалом. Так как аррорут может угождать в царапину …

Что пропускают виниловые перчатки

Что пропускают виниловые перчатки … Различают одноразовые перчатки из винила, нитрила и латекса. … Изделия изготавливаются из нитрила, синтетического заменителя каучука, который в …

Нитриловые перчатки: что это такое и где их используют?

Jun 28, 2020·Подробное описание нитриловых перчаток их харектеристики и сферы применения. Широкий ассортимент нитриловых перчаток в интернет магазине Доля – опт и розница

Термотаблетка убл: Термотаблетка убл – Лучшая цена …

Из-за того что дверца не блокируется, стиральная машина не приступает к стирке. Мастер диагностирует плату, выявляет, что сгорело, меняет неисправные элементы на новые и пропаивает дорожки.

Виниловые перчатки что это такое? – Ответы на вопросы о …

Содержание1 Какие перчатки лучше: Латексные, нитриловые или виниловые?1.1 Неопудренные и опудренные перчатки 1.2 Где купить одноразовые перчатки?2 Перчатки виниловые — лучшие для тонких и точных работ,2.1 Перчатки …

Перчатки хозяйственные Paterra Нитриловые – «Что за зверь …

Jul 04, 2015·Всем привет! Сегодня я дорвалась до написания отзывов)) На этот раз герои моего отзыва нитриловые перчатки Paterra Не знаю как для вас, а для меня тема о перчатках актуальная)) Так как я никак не найду свои идеальные …

Перчатки нитриловые или латексные что лучше

Перчатки нитриловые или латексные что лучше Перчатки нитриловые или латексные что лучше ЧЕМ ОТЛИЧАЮТСЯ ЛАТЕКСНЫЕ, НИТРИЛОВЫЕ, ВИНИЛОВЫЕ ПЕРЧАТКИ?

смотровые перчатки publix из нитрила

Партнер по сотрудничеству «Перчатки нитриловые, розовые, SunViv» — Результаты …- смотровые перчатки publix из нитрила ,Перчатки нитриловые широко используются в косметологии (при проведении процедур и окраскaе волос).

электростатические перчатки graco для латекса

Кроме того, стандарты astm для перчаток имеют разные требования на прочность и растяжение для латекса, нитрила, и винила. Более низкая цена на перчатки означает, что они хуже.

Нитриловые перчатки М (7-8) Nitrylex® PF PROTECT / basic …

Устойчивость нитрила к проколам и прочность на растяжение также значительно выше, чем у латекса и других пленок, что используются для изготовления перчаток – нитрил …

Как определить что это нитриловые перчатки

Из нитрильных каучуков производят одноразовые нитриловые перчатки, автомобильные приводные ремни, шланги, уплотнительные кольца, прокладки, сальники, синтетическую кожу, формы роликов …

что такое нитриловые смотровые перчатки

Что такое нитриловые перчатки и для чего они нужны. Нитриловые перчатки используются во многих областях человеческой деятельности и отлично защищают не только от физических повреждений, но и от загрязнений …

одноразовые медицинские перчатки бесплатная доставка …

Голубые нитриловые перчатки Medicom SafeTouch Advanced E … Голубые нитриловые перчатки Medicom SafeTouch Advanced E-series без пудры – перчатки сочетающие в себе все свойства нитрила и элегантный черный цвет.

Перчатки из полимерных материалов что это? – О …

Перчатки из полимерных материалов что это? Содержание 1 Какие перчатки лучше: нитриловые, виниловые или латексные

Перчатки из полимерных материалов что это? – О …

3.1 Перчатки из трикотажа для огорода — что особенного? 3.2 Преимущества и недостатки обеих моделей; 4 Какие перчатки лучше: нитриловые, виниловые или латексные. 4.1 Защитные перчатки – виды

Мир переводов :: Перчатки из нитрила: что нужно знать?

Aug 11, 2015·Некоторые одноразовые перчатки из нитрила черного цвета имеют технологию защиты от потоотделения, что делает их идеальными для механиков и торговцев на открытом воздухе летом в Австралии.

виниловые перчатки антибактери корупси падав

Виниловые медицинские перчатки купить в Украине. Выбрать …- виниловые перчатки антибактери корупси падав ,Купить 523 товаров в Украине ☛ Фото и низкие цены в каталоге раздела “Виниловые медицинские перчатки …

Перчатки из полимерных материалов что это? – О .

..

3.1 Перчатки из трикотажа для огорода — что особенного? 3.2 Преимущества и недостатки обеих моделей; 4 Какие перчатки лучше: нитриловые, виниловые или латексные. 4.1 Защитные перчатки – виды

В мире одноразовых перчаток есть виниловые перчатки. Не …

В мире одноразовых перчаток есть виниловые перчатки. Не дорогие, но быстро рвутся.廊 ⠀ Нитриловые перчатки. Прочные, комфортные, но дорогие. 類 ⠀ Но есть витриловые перчатки. Они сочетают лучшие…

2001.75. Ford Transit … – PDF Free Download

Sep 24, 2018·Если элементы были изготовлены из натурального каучука или нитрила, они не опасны. При наличии сомнений будьте осторожны и лучше предположите худшее, т.е., что в качестве материала …

одноразовые медицинские перчатки бесплатная доставка …

Голубые нитриловые перчатки Medicom SafeTouch Advanced E … Голубые нитриловые перчатки Medicom SafeTouch Advanced E-series без пудры – перчатки сочетающие в себе все свойства нитрила и элегантный черный цвет.

нитриловые перчатки таблица спецификаций процедуры проверки fda

Партнер по сотрудничеству

Пол — Стройка. Ремонт. Дача. Благоустройство.- нитриловые перчатки таблица спецификаций процедуры проверки fda ,Монтаж пола: винты для установки лаг В том случае, когда лаги полов нужно установить в здании с деревянными перекрытиями, как правило, вопросов не возникает.Норма расхода тосола на 100 л топлива: Норма расхода …НЕОБХОДИМЫЕ ПРОВЕРКИ. Описанные ниже проверки являются простыми, но важными. … 1998), вполне вероятно, что эти процедуры не приносят пользы из-за скорости, с которой абсорбируется EG (Davis et al. др …

Термотаблетка убл: Термотаблетка убл – Лучшая цена …

Для проверки отдельно запускаем отжим. Если стиральная машина не совершает слив воды, переходим на проверку насоса.

Нитриловые Перчатки | База поставщиков на Qoovee

нитриловые Перчатки. CE Certificate ( EN 455, EN420 or EN374 ), ISO, FDA.

РЕГУЛЯТОРЫ КИСЛОТНОСТИ | Ataman Kimya A.Ş.

Согласно fda, уксусная кислота и ее натриевая соль диацетат натрия являются gras или «общепризнанными безопасными». epa отмечает, что нет причин для беспокойства.

04.05.2021 — kontakt-keramika.ru — Керамическая плитка

May 04, 2021·4. Деревянная дубинка для шин. Используют водители-дальнобойщики для проверки давления в шинах авто. Формально разрешенный аксессуар, который может использоваться для самозащиты.

Склеить два куска резины: Чем склеить резину с резиной …

Jun 04, 2021·Именно поэтому, несмотря на fda-одобренность в случае местного применения в случае ран, пока еще нет единого мнения по остальным направлениям применения (кардио- и …

tiffany белое золото

The profile of Tiffanys rectangular Lucida diamond is gracefully enhanced by triangular side stones. Tiffany белое золото , США

Чистка дымохода крахмалом: Чистка дымохода от сажи …

Печка — непременный атрибут многих загородных домов. А уж бань тем более. Чтобы печка правильно функционировала, была безопасна в использовании, хорошо нагревала дом и долго держала тепло, за ней нужно следить.

годовой отчет – UNDP in Kyrgyzstan

годовой отчет – UNDP in Kyrgyzstan. Реклама. Полноправные люди. Устойчивые страны. ГОДОВОЙ ОТЧЕТ о реализации в Кыргызской Республике грантов Глобального Фонда для борьбы со СПИДом, туберкулезом и …

Препараты на основе клеток и тканей

Препараты на основе клеток и тканей. Введение. Данная общая статья представляет собой всесторонний обзор аспектов разработки препаратов на основе клеток и тканей. Набор терминов, наиболее часто употребляемых в …

ГОСТ ISO 23409-2014 Презервативы мужские из …

ГОСТ iso 23409-2014 . МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ. ПРЕЗЕРВАТИВЫ МУЖСКИЕ ИЗ СИНТЕТИЧЕСКИХ …

Бондарчук Сергій Федорович.

Європейці та Таврія

Бондарчук Сергій Федорович. Сергій Бондарчук народився 25 вересня 1920 року в селі Білозерка Херсонського району Української РСР.

Начало – Пчелометр. Удобства для пчеловодства

Как это работает? Основную часть времени устройство спит. Как только срабатывает один из будильников, устройство просыпается, опрашивает датчики, взвешивает платформу, запоминает показания и в зависимости от …

Documents & Reports – All Documents | The World Bank

Пособие по безопасности пищевой продукции Международная финансовая корпорация (IFC), входящая в Гр

ГОСТ Р ИСО 13022-2016 Продукты медицинские, содержащие …

ГОСТ Р ИСО 13022-2016; Статус:Принят; Продукты медицинские, содержащие жизнеспособные человеческие клетки. Применение менеджмента риска и требований к методикам обработки

Как увеличить мощность блока питания компьютера своими …

Но позже после проверки оказалось, что родные конденсаторы тоже неплохие и имеют довольно низкое внутреннее сопротивление. Поэтому в итоге автор впаял их обратно.

05.05.2021 — serovodorod-okt.ru — Октябрьская Мацеста

May 05, 2021·Особые указания. У пациентов со склонностью к артериальной гипотензии препарат применяется в меньших дозах и под контролем артериального давления, при его снижении ниже привычного уровня прием прекращается.

Аккумулятор red horse отзывы: Аккумуляторы Red отзывы

Недостатки AGM аккумуляторов. # 1: DieHard Platinum AGM (370–900 CCA) # 2: Аккумуляторы Optima Red Top (720-800 CCA) № 3: ACDelco Professional AGM (800 CCA) # 4: Bosch Platinum AGM Series (от 440 до 650 CCA) № 5: ACDelco Advantage AGM (325 …

Неясный слитно или раздельно: Как пишется “НЕЯСНО” или …

Комбинированные продукты передаются в центр fda, который будет иметь основную юрисдикцию для проведения предпродажной проверки и регулирования.В соответствии с разделом …

Токарный станок тв 6м технические характеристики: ТВ-6М …

Jun 18, 2021·Станок ТВ-6М имеет 6 скоростей шпинделя за счет переключения шестерен в коробке передней бабки, 3 скорости подач суппорта, может нарезать 3 метрические резьбы без перестановки шестерен в гитаре.

1970 – Сайт Ветеранов Ростова-на-Дону

Таблица 1 Нежелательные эффекты . Системный орган, класс . Частота . Побочная реакция . Инфекции и инвазии . Очень редко . Фурункул . Заболевания крови и лимфатической системы . …

Регулировка карбюратора жигули: Регулировка карбюратора …

Регулировка карбюратора ВАЗ 2109. Как отрегулировать холостой ход карбюратора ВАЗ 2109

Пособие по БПП IFC

Процедуры и корректирующие действия 1.4. Внутренние и внешние проверки 1.5. Браковка и выпуск продукции 1.6.

ftv | DocumentBase: обмен учебными документами

Aug 19, 2020·Теоретическая часть 1. Введение в фармацевтическое товароведение С какими науками связано …

Сколько групп допуска по электробезопасности: Page not …

8. Диэлектрические перчатки. Диэлектрические боты и галоши. Диэлектрические коврики, 4 часа (из них 2 часа практические занятия). 9.

Нам нужны нитриловые перчатки в количестве 200 миллионов …

Jul 28, 2020·8901. Нам нужны нитриловые перчатки в количестве 200 миллионов коробок (100штук) Размеры S, M, L, XL. Оплата строго L/C. Наличие сертификатов CE, FDA, ISO. Цена …

Нитриловые перчатки. Подбор по характеристикам …

Нитриловые перчатки с ромбовидной ярко выраженной структурой Удлиненная манжета Блок: 25 пар (50 шт) Прочные нитриловые универсальные перчатки. Предназначены для …

Замок стиральной машины УБЛ: принцип работы, диагностика, замена

Замок стиральной машины — это защитный механизм, гарантирующий сохранение герметичности во время работы. Блокиратор препятствует непроизвольному открытию крышки в процессе работы, а также останавливает программу стирки, если люк закрыт неплотно.  Как и основная часть деталей, замок подвержен износу, поэтому необходимо своевременно его заменять.

Разновидности устройств блокировки люка

Для современных моделей стиральных машин разработано два варианта УБЛ:

  • электромагнитный;
  • биметаллический.

Главным минусом первого варианта является тот факт, что работает замок только при наличии электричества в сети. В последнее время большинство производителей постепенно стали отказываться от электромагнитных устройств.

Биметаллическое УБЛ является более совершенным вариантом блокировки люка. В принципе его работы заложено использование напряжения для нагрева термического элемента. От него высокая температура переходит к биметаллической пластине, она давит на рычаг, который блокирует люк.

Когда стирка завершена, пластина остывает и возвращается на место. В результате этих действий люк разблокируется.

Основным преимуществом данного типа УБЛ является то, что люк открывается после полного слива воды, а постиранное белье можно достать, даже если нет электричества.

Принцип работы биметаллического УБЛ

Если замок некорректно работает, то лучше сразу произведите его замену. Однако у среднестатистического человека могут возникнуть затруднения с поиском и покупкой подходящей модели. Конечно, можно попросту заказать оборудование в сервисном центре, но это займет некоторое время и потребует затратить дополнительные средства.  Гораздо проще будет определиться, если точно выявить причину неисправности замка. Для этого вам необходимо разобраться в его устройстве и принципе работы.

Обычно блокираторы при изготовлении помещают в пластиковый корпус. В крайней части механизма предусмотрено отверстие для крепления кольца пружины, соединяющей всю систему с люком. Детали замка следующие:

  • железная пластинка, соединенная с пружиной крышки загрузочного люка;
  • терморезистор;
  • биметаллическая деталь, меняющая размеры, реагируя на температуру;
  • несколько контактов;
  • штифт.

Принцип действия блокиратора довольно прост. После закрытия крышки крючок, сцепившись с замком, воздействует на пластинку, придавая ей необходимое положение. После подачи сигнала блокировки крышки, на терморезистор поступает электрический ток, биметаллическая деталь изменяет форму, продавливая штифт. Входя в отверстие, штифт надежно блокирует перемещение подвижной пластины, тем самым фиксируя люк.  После этого замыкаются контакты, расположенные во внутренней части замка, и подается сигнал о том, что люк стиральной машины надежно закрыт.  Для разблокировки системы достаточно отключить напряжение на терморезисторе.

Как понять, что замок блокировки сломан

Понять, что возникли проблемы с УБЛ, можно по некоторым признакам:

На стиральной машине LG при невозможности закрыть дверцу появляется ошибка DE

Читайте подробнее об этой и других ошибках СМА от LG.

Проверить, работает УБЛ или нет, можно с помощью мультиметра. Для этого обязательно нужно демонтировать замок. Сделать это можно так.

  1. Открыть люк стиральной машины.
  2. Найти проволочное кольцо и вытащить его с помощью отвертки.
  3. Выправить манжет, чтобы можно было вытащить замок.
  4. Выкрутить крепеж и демонтировать замок.

Подробнее о том, как открыть машинку, если заблокирована дверь, читайте здесь.

После этого необходимо осмотреть схему замка и определить, какой контакт является фазой, нейтральным или общим. Дело в том, что у всех производителей их расположение отличается, поэтому без этих действий проверка мультиметром бесполезна.

Если же с контактами все понятно, то необходимо выполнить проверку в следующей последовательности.

  1. Переключить устройство в режим проверки.
  2. Берется мультитестер. Один щуп крепится к нейтральному контакту, другой к – фазовому.
  3. Трехзначные показания на дисплее указывают на отсутствие проблем.
  4. После этого щупы перемещаются на общий и нейтральный контакт.
  5. При цифрах 0 или 1 на дисплее можно с уверенностью сказать, что УБЛ неисправно.

Если никаких проблем при проверке замка люка не выявлено, то следует искать причину неисправности в механике. Понять это можно по основному признаку – даже через несколько часов после отключения машинки люк будет заблокирован. Также на дисплее может появиться код ошибки, свидетельствующей о поломке УБЛ. Еще один фактор, указывающий на неисправность – люк машинки совсем не блокируется. Это может быть связано как с поломкой замка, так и модуля управления. Последний может продиагностировать и отремонтировать только специалист по ремонту СМА.

Как заменить сломанное УБЛ

Ремонт и замена самого УБЛ — не слишком сложное занятие, и выполнить его можно собственными руками. Для этого достаточно иметь минимальные знания о ремонте бытовой техники. Если же уверенности в своих силах нет, тогда стоит обратиться к специалистам в сервисный центр или вызвать мастера на дом.

Если деталь меняется, то необходимо подобрать полностью аналогичный вариант. Новая защелка должна соответствовать модели и серийному номеру старого узла. Перед установкой необходимо извлечь старый механизм. Далее монтаж нового замка производится в следующей последовательности.

  1. УБЛ соединяется с проводкой.
  2. Замок устанавливается на место.
  3. Фиксируется с помощью крепежа.
  4. Устанавливаются хомуты и манжеты.

Читайте также: как провести ремонт дверцы СМА своими руками.

После завершения работ необходимо убедиться в безопасности бытовой техники. Для этого нужно:

  • проверить заземление машинки;
  • проверить, что техника выставлена по уровню;
  • установить устройство защитного отключения, которое обезопасит машинку от скачков напряжения.

В любом случае, при малейших подозрениях на протечки, необходимо сразу обратиться к специалистам.

Если вовремя производить замену изношенных деталей и внимательно следить за стиральной машиной она будет качественно выполнять свои функции долгие годы. Регулярная профилактика поможет предотвратить поломки, а тщательный уход поможет избежать появления плесени и неприятного запаха.

Какие мл являются нитриловые перчатки Superieur pdf бесплатно

Партнер по сотрудничеству

Выбрать и купить огнетушители Bontel для квартиры, дома …- Какие мл являются нитриловые перчатки Superieur pdf бесплатно ,Nov 18, 2015·Отдельные экземпляры, по официальному заключению АГПС МЧС РФ, вообще являются потенциально опасными. Они просто откажутся работать в тот момент, когда у них попросят помощи.Как сделать стол из дерева: как сделать деревянный столик …Соедините так, чтобы вдоль концов и краев не было или почти не было зазора. Постарайтесь, чтобы какие-либо дефекты попали в области древесины, …

Как протравить плату: Изготовление печатных плат .

..

В 200 мл воды (осторожно!) заливают 20-30 мл серной кислоты (именно кислоту в воду, а не наоборот!). В приготовленный раствор кидают 4-6 таблеток перекиси водорода.

Некоторые аспекты производства крафтовых продуктов | Пикабу

Mar 13, 2019·Некоторые аспекты производства крафтовых продуктов — пост пикабушника Cranz. Комментариев – 9, сохранений – 9. Присоединяйтесь к обсуждению или опубликуйте свой пост!

Силуэт девушки черно белый рисунок: Картинки d1 87 d0 b5 …

Силуэт девушки черно белый рисунок: Картинки d1 87 d0 b5 d1 80 d0 bd d0 be d0 b1 d0 b5 d0 bb d1 8b d0 b9 d1 81 d0 b8 d0 bb d1 83 d1 8d d1 82, Стоковые Фотографии и Роялти-Фри Изображения d1 87 d0 b5 d1 80 d0 bd d0 be d0 b1 d0 b5 d0 bb d1 8b d0 b9 d1 81 d0 b8 d0 bb d1 83 d1 8d d1 82

Гальваника это википедия: Гальваника — это… Что такое …

Позитив («мать», англ. positive, mother) — металлический диск с дорожками («позитивный»), отпечатками которого являются штампы. Сам позитив, в свою очередь, является отпечатком мастера (мастер . ..

Первая помощь при кровотечениях и ранениях кратко: Первая …

Первая помощь при ушибах, порезах и ссадинах. Ушибы и ссадины часто случаются с нами именно летом, ведь это время активного отдыха, дачных работ и ежедневных прогулок в парке.

Пена монтажная зимняя технические характеристики: Пена …

forvardplast.ru – Декоративная пленка ПВХ для подоконников. Производство и оптовая продажа декоративной пленки ПВХ для ламинирования изделий ПВХ

Технология наливного пола своими руками: Как сделать …

Castorama Вольский тракт, д.2, ТЦ “HappyМолл” +7 8452 669-339 51.620186592316 45.971478828033. Leroy Merlin г. Саранск, Северо-восточное ш., д. 17 8 …

Análisis De La Cobertura De Daños Por La Acción Del Agua U …

Entre los riesgos asegurables existentes y que generalmente están entre los más polémicos en el caso de producirse siniestros, están las coberturas que amparan contra los daños por la acción del agua u otras sustancias liquidas.

В цементный раствор добавить жидкое стекло: Как правильно .

..

В цементный раствор добавить жидкое стекло: Как правильно смешать жидкое стекло с цементом: пропорции, советы и рекомендации

Своими руками — VPM — Автозапчасти для иномарок

Какие основные моменты следует учитывать … на 2 литры воды — 200 мл моющего для посуды или 10 ложек стружки мыла. Очистка проводится поэтапно: … Не забудьте надеть нитриловые перчатки, чтобы …

Принцип работы вибрационного насоса малыш: принцип …

Мы должны уметь использовать теорию групп, чтобы выяснить, какие колебания молекула может на самом деле имеют.2. Шаг 1. Используем координаты смещения. Шаг 2. Функциональный тест 8-го класса pdf

Перчатки нитриловые неопудренные – «LabPlus»

Перчатки нитриловые неопудренные представлены в интернет-магазине «LabPlus» широким ассортиментом . У нас на сайте вы имеете возможность приобрести Перчатки …

Перчатки нитриловые медицинские | ЛУЧШАЯ ЦЕНА!

Нитриловые перчатки (разновидность синтетического каучука) – это перчатки, которые создают более надежную защиту от агрессивных химикатов по сравнению с латексом.

виниловые пластинки

-в какие игры и игрушки играли дети викторианской эпохи-5 Демонических Живых Кукол Снятых На Камеру-Одичавшие Дети-Этикет викторианской Англии-Викторианская Литература

Что такое нитриловые перчатки, стоимость, свойства и госты

Нитриловые перчатки являются хорошей альтернативой латексным изделиям, поскольку материал не вызывает аллергических реакций и более устойчив к различным химическим …

“Медицинские изделия” №6(6) by Издательский холдинг ЗАО …

Oct 28, 2013·Специализированное издание для ЛПУ, поликлиник и медцентров № 6, 2013 г. Ранее, с 2000 г. по 2012 г …

Что делать если ты разбил градусник: РАЗБИЛСЯ ГРАДУСНИК …

Шаг 1: помести градусник в герметичный сосуд. Шаг 2: утилизация. Что категорически не рекомендуется предпринимать, если разбили ртутный термометр. Ситуация 2: …

Термотаблетка убл: Термотаблетка убл – Лучшая цена …

/ Об.) Фетальной бычьей сыворотки, антибиотиков (100 единиц / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина) и 2 мМ глутамина. Клетки инкубировали при 37 ° c в инкубаторе co 2 .

05.04.2021 — Шины для спецтехники, шины для погрузчика …

Apr 05, 2021·Какие же это виды и каковы их особенности? … Бункер вмещает 1000 мл краски, чего достаточно для выполнения небольших работ без необходимости даже заливки краски. … Используйте нитриловые …

Los mitos del embarazo – Metamorfic – Centro de Estética y …

Mar 24, 2014·Son muy frecuentes los consejos de amigas o familiares, acerca de lo que ocurre en el embarazo, siempre con muy buena intención. Pero aveces son desorientadores, confusos y hasta en ocasiones preocupantes. Aquí dejo los mitos mas clásicos y sus verdades científicas (o lo mas parecido) 1. La mujer que está en periodo de puerperio …

Аптечка для предприятия – Мой сертификат

Jun 30, 2021·<p> Министерство здравоохранения РФ издало приказ от 14.04.2020 № 327н, который ввел мораторий на медицинские сертификаты. Однако же данный документ вызвал большое число вопросов со стороны медицинского сообщества . ..

Нитриловые перчатки

Нитриловые перчатки. Руки косметолога — это очень важный инструмент в его работе. Их необходимо беречь, используя средства защиты при работе с агрессивными …

Гостинично-банный комплекс “Командировка” Черкассы — …

Гостинично-банный комплекс “Командировка”, приглашает Вас, хорошо провести свой досуг и оздоровиться в Черкассах. В комплексе есть всё для того, чтобы предоставить своим клиентам самые лучшие условия для получения …

Сколько хранится кровь на анализ

Какие лекарства положены детям бесплатно? Узнайте об этом из нашей статьи. Результаты исследований в медицине, так называемые анализы – это не просто бумажки , точное определение этого …

Video: Potápění v blátě – Vestigium

Video z potápění v Poděbradech na písaku. Napsal Mirek, 11. května 2010 v 18:58: Ahoj. Snad se nebudete zlobit. Rozesmálo mne když jsem koukal na Jirku jak leze do jezera a boří se do jilu-písku na kraji.Jako beruška na medu.-)))

Soffleatt – Форум

Jan 05, 2018·Ознакомившись с личным кабинетом, и опробовав все его функции, вы сможете быстро создавать заказы и эффективно продвигаться в поисковых системах Google, Yandex. Факт в том, что прогоны по соц …

Модульный набор инструментов для создания сложных полимерных архитектур убиквитина с использованием ферментов ортогональной сортировки

Плазмиды и реагенты

Оптимизированные для кодонов человека SUMO2, Ub и H 6 -Rap80 (1–137) −7A-Linker были приобретены как ДНК Строки (GeneArt, Thermo Fisher) и клонировали в векторы pPylT и pET17b с помощью стандартного рестрикционного клонирования (см. Дополнительную таблицу 3). Точечные мутации, вставки и делеции вводили с использованием сайт-направленного, лигазно-независимого мутагенеза (SLIM) 15 .Были приобретены Srt5M, Srt4S и Srt2A в векторах pET29b (плазмиды Addgene № 75144, № 75146 и № 75145). Также был приобретен SENP2 в pET28a (плазмида Addgene # 16357). Олигонуклеотидные праймеры были сконструированы с помощью NEBuilder и приобретены у Sigma-Aldrich (см. Дополнительные таблицы 1 и 2). Аминокислотные последовательности всех белков перечислены в дополнительном примечании 1.

Все растворители и химические реагенты были приобретены у Sigma – Aldrich, Carbolution, Acros Organics или Fisher Scientific и использовались без дополнительной очистки, если не указано иное.ЖХ-МС белков проводили на системе ЖХ-МС Agilent Technologies 1260 Infinity с квадрупольным спектрометром 6310. Система растворителей состояла из 0,1% муравьиной кислоты в воде в качестве растворителя A и 0,1% муравьиной кислоты в ACN в качестве растворителя B. Белки измеряли на колонке Phenomenex Jupiter C4 300 A LC (150 × 2 мм, 5 мкм). Образцы белка анализировали в положительном режиме, а также по УФ-поглощению при 193, 254 и 280 нм. Пятнадцать процентов гелей SDS-PAGE запускали (170 В в течение 60 мин) в системе Bolt TM Mini Gel Tank (Invitrogen).Гели окрашивали Quick Coomassie Stain (Generon). В качестве белкового маркера использовали цветовой стандарт предварительно окрашенного белка, широкий диапазон 11–245 кДа (NEB) или широкий диапазон 10–250 кДа (NEB). Концентрации белка и ДНК измеряли на NanoPhotometer ® NP60 (Implen). H 6 -UBE1 был приобретен в Boston Biochem (каталожный номер E-304-050). Ni-NTA агароза была приобретена у Jena Bioscience (каталожный № AC-501). Вестерн-блоттинг выполняли на системе сухого блоттинга iBlot 2 (Life Technologies) с использованием метода P0 (20 В в течение 1 минуты, 23 В в течение 4 минут, 25 В в течение 2 минут).После блоттинга мембрану из нитроцеллюлозы / ПВДФ блокировали 5% раствором сухого обезжиренного молока в буфере 1 × TBST (1 ч, КТ) и обрабатывали желаемым антителом в соответствии с инструкциями производителя. Белки визуализировали с помощью ECL-спрея WesternBright (Advansta) с использованием системы визуализации iBright FL1500 (Thermo Fisher Scientific). Антитело против убиквитина K63, специфичное по связыванию, было приобретено у Abcam (ab179434, 1: 5000), а вторичное антитело против мыши (каталожный № A4416, 1: 5000) было приобретено у Sigma-Aldrich. N 6 – ((2-азидоацетил) глицил) -L-лизин (Азидо-GGK или AzGGK) синтезировали с помощью твердофазного пептидного синтеза (SPPS), как описано перед 18 .

Экспрессия и очистка белка

Получение GGK-содержащих POI

Химически компетентные Клетки E. coli K12 были котрансформированы с помощью pPylT_POI (который кодирует Mb, тРНК CUA и H на С-конце 6 POI с одним или двумя кодонами TAG в обозначенных положениях (см. дополнительную таблицу 3)) и плазмиды pBK_aaRS (которая кодирует wt Mb aaRS или Mb AzGGKRS).После восстановления 1 мл среды SOC в течение 1 ч при 37 ° C, клетки культивировали в течение ночи в 50 мл неиндуцирующей среды 55 с добавлением тетрациклина (17,5 мкг / мл) и ампициллина (100 мкг / мл) при 37 °. С, 200 об. / Мин. Ночную культуру разводили до OD 600 0,05 в среде для автоиндукции 55 , содержащей антибиотики (тетрациклин (8,75 мкг / мл) и ампициллин (50 мкг / мл)) и соответствующую неприродную аминокислоту (UAA; либо 2 мМ. BocK или 4 мМ AzGGK). После инкубации в течение ночи при 37 ° C клетки собирали центрифугированием (4000 × g , 20 мин, 4 ° C), мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C. Полученные осадки клеток оттаивали на льду и ресуспендировали в буфере для лизиса (20 мМ Трис pH 8,0, 300 мМ NaCl, 0,1 мг / мл ДНКазы I (AppliChem), одна таблетка ингибитора протеазы cOmplete TM (Roche) и 0,175 мг / мл PMSF). Затем суспензию клеток инкубировали на льду в течение 30 мин и обрабатывали ультразвуком при охлаждении на бане с ледяной водой. Лизированные клетки центрифугировали (15000 × g , 40 мин, 4 ° C) и прозрачный лизат добавляли к 1 мл суспензии Ni-NTA / 1 л культуры (Jena Bioscience), уравновешенной промывочным буфером (20 мМ Tris pH 8. .0, 300 мМ NaCl и 30 мМ имидазол). После этого смесь инкубировали при перемешивании в течение 1 ч при 4 ° C. После инкубации смесь переносили в пустую пластиковую колонку и промывали 10 объемами колонки (CV) промывочного буфера. Белок элюировали фракциями по 1 мл промывочным буфером с добавлением 300 мМ имидазола, pH 8,0. Фракции, содержащие POI (идентифицированные с помощью 15% SDS-PAGE), были объединены, сконцентрированы и повторно забуферены (50 мМ Трис pH 7,5 и 150 мМ NaCl) с использованием центробежных фильтров Amicon ® (Millipore) с подходящей отсечкой по молекулярной массе (MWCO ). Концентрацию белка рассчитывали по измеренному поглощению A 280 (коэффициенты экстинкции рассчитывали с помощью ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)). В случае Ub и SUMO определение концентрации белка с использованием поглощения при 280 нм неточно (из-за их низкого коэффициента экстинкции (ε)), поэтому для определения точная концентрация белка. POI с включенными UAA мгновенно замораживали с использованием жидкого азота и хранили при -80 ° C до дальнейшего использования.

Типичная шкала экспрессии AzGGK составляла 1 л. В зависимости от положения кодона TAG были выделены ~ 5-20 мг / л SUMO, 5-15 мг / л Ub и 20-40 мг / л GFP.

Восстановление азидного фрагмента AzGGK до амина (GGK) проводили на очищенных белках путем добавления 2 экв. 2- (дифенилфосфино) бензойной кислоты (2DPBA) или трис- (2-карбоксиэтил) -фосфина (TCEP) с последующей инкубацией в течение 1 ч при комнатной температуре и последующей повторной буферизацией для удаления избытка 2DPBA / TCEP. Восстановление по Штаудингеру контролировали с помощью ЖХ-МС.

Отщепление H
6 -метки от SUMO2- (KxGGK) -H 6 вариантов с использованием SENP2

После элюирования SUMO2-KxGGK-H 6 из Ni-NTA, элюат (2 мл) был разбавлен в 20 мл буфера для расщепления (50 мМ Трис pH 7,5, 150 мМ NaCl и 0,5 мМ DTT) и 100 мкл протеазы SUMO (SENP2) (с меткой H 6 , 1,4 мг / мл) были добавлены с последующей инкубацией при КТ в течение 30 мин. ЖХ-МС использовали для подтверждения завершения отщепления метки H 6 от С-конца SUMO2-KxGGK-H 6 .После успешного расщепления реакционную смесь добавляли к уравновешенному Ni-NTA (200 мкл / 1 мг SUMO2-KxGGK) и инкубировали при 4 ° C в течение 1 ч при перемешивании. После инкубации смесь переносили в пустую пластиковую колонку, поток собирали, концентрировали и повторно забуферивали (50 мМ Трис, pH 7,5, 150 мМ NaCl) с использованием центробежных фильтров Amicon ® с MWCO 3 кДа. Концентрацию белка определяли с помощью анализов BCA (Thermo Scientific ™) и Брэдфорда (Sigma-Aldrich). SUMO2-KxGGK без тегов мгновенно замораживали с использованием жидкого азота и хранили при -80 ° C до дальнейшего использования.

Отщепление метки H
6 от Ub- (KxGGK) -H 6 вариантов с использованием USP2

H 6 Расщепление метки от Ub-KxGGK-H 6 проводили аналогичным образом, как описано выше для отщепления метки H 6 от SUMO2-KxGGK-H 6 с использованием деубиквитилазы (100 мкл USP2, 2 мг / мл) вместо протеазы SUMO (SENP2).

Экспрессия и очистка мутантов сортировки

Химически компетентный E. coli BL21 (DE3) трансформировали плазмидой pET29b_Srt-H 6 или pET29b_Srt-TEV-H 6 (см. Дополнительную таблицу 3).После восстановления с использованием 1 мл среды SOC в течение 1 ч при 37 ° C, клетки культивировали в течение ночи в 50 мл 2 × YT-среды, содержащей канамицин (50 мкг / мл), при 37 ° C, 200 об / мин. Ночную культуру разбавляли до OD 600 0,05 в 3 л свежей среды 2 × YT с добавлением канамицина (25 мкг / мл) и культивировали при 37 ° C при встряхивании (200 об / мин) до OD 600 = 0,5–0,8 было достигнуто. Добавляли IPTG до конечной концентрации 0,4 мМ и индуцировали экспрессию белка в течение трех часов при 30 ° C.Клетки собирали центрифугированием (4000 × г , 20 мин, 4 ° C) и ресуспендировали в буфере для лизиса (50 мМ Трис pH 8,0, 300 мМ NaCl с добавлением 1 мМ MgCl 2 , 0,1 мг / мл ДНКазы I. (AppliChem), одна таблетка ингибитора протеазы cOmplete TM (Roche) и 0,175 мг / мл PMSF). Клетки лизировали ультразвуком при охлаждении на бане с ледяной водой и центрифугировали (15000 × г, , 40 мин, 4 ° C). После этого очищенный лизат добавляли к суспензии Ni-NTA (Jena Bioscience) (1 мл суспензии на 1 л культуры) и уравновешивали промывочным буфером (20 мМ Трис, pH 8.0, 300 мМ NaCl, 30 мМ имидазол). Затем смесь инкубировали при перемешивании в течение одного часа при 4 ° C. После инкубации смесь переносили в пустую пластиковую колонку и промывали 10 CV промывочного буфера. Белок элюировали фракциями по 1 мл промывочным буфером с добавлением 300 мМ имидазола, pH 8,0. Фракции, содержащие белок, были объединены, сконцентрированы и повторно забуферены (20 мМ Tris pH 7,5, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl 2 ) с использованием центробежных фильтров Amicon ® Ultra-4 10 K MWCO (Millipore).Концентрацию фермента рассчитывали по измеренному поглощению A 280 (коэффициенты экстинкции рассчитывали с помощью ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)). Все варианты сортировки мгновенно замораживали с использованием жидкого азота и хранили при -80 ° C до дальнейшего использования.

Варианты сортировки, несущие C-концевой тег TEV-H 6 , экспрессировали и очищали идентично. Чтобы отщепить метку H 6 , фракции, содержащие белок, были объединены и 200 мкл протеазы TEV (1.8 мг / мл). Смесь переносили в трубку для диализа (Roth) и мешок для диализа погружали в 2 л холодного буфера для диализа (25 мМ Tris pH 8,0, 150 мМ NaCl, 0,5 мМ DTT) и перемешивали при 4 ° C в течение ночи. Белковую смесь извлекали из диализной трубки и центрифугировали (15000 × g, , 10 мин, 4 ° C) для осаждения протеазы TEV. К супернатанту добавляли 1 мл суспензии Ni-NTA (Jena Bioscience) на 1 л культуры, уравновешенной диализным буфером, и смесь инкубировали при перемешивании в течение 1 ч при 4 ° C.Затем смесь выливали в пустую пластиковую колонку и собирали поток через нее. Гранулы Ni-NTA дважды промывали 15 мл промывочного буфера (20 мМ Tris pH 8,0, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl 2 ). Проточные и промывные фракции, содержащие очищенную сортазу без метки H 6 , были объединены, сконцентрированы и повторно забуферены (50 мМ Трис pH 7,5, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl 2 ) с использованием Amicon ® Ultra-4 10 K Центробежные фильтровальные установки MWCO (Millipore). Концентрацию фермента рассчитывали по измеренному поглощению A 280 (коэффициенты экстинкции рассчитывали с помощью ProtParam (https: // web.expasy.org/protparam/)). Все варианты сортировки мгновенно замораживали с использованием жидкого азота и хранили при -80 ° C до дальнейшего использования.

Экспрессия и очистка убиквитина без тегов и вариантов убиквитина

Химически компетентный E. coli Rosetta2 (DE3) трансформировали плазмидой pET17b-убиквитин (см. Дополнительную таблицу 3). После восстановления 1 мл среды SOC в течение одного часа при 37 ° C, клетки культивировали в течение ночи в 50 мл 2 × YT-среды, содержащей ампициллин (100 мкг / мл) и хлорамфеникол (50 мкг / мл), при 37 ° C, 200 об. / Мин.Ночную культуру разбавляли до OD 600 0,05 в 3 л свежей среды 2 × YT с добавлением ампициллина (50 мкг / мл) и хлорамфеникола (25 мкг / мл) и культивировали при 37 ° C при встряхивании (200 об / мин. ) до OD 600 = 0,8–1,0. IPTG добавляли до конечной концентрации 1 мМ и экспрессию белка индуцировали в течение 4 часов при 37 ° C. Клетки собирали центрифугированием (4000 × g, , 20 мин, 4 ° C) и ресуспендировали в буфере для лизиса (50 мМ Tris pH 7,6, 10 мМ MgCl 2 , 1 мМ EDTA, 0.1% NP-40, 0,1 мг / мл ДНКазы I, одна таблетка ингибитора протеазы cOmplete TM и 0,175 мг / мл PMSF). Клетки лизировали ультразвуком при охлаждении на бане с ледяной водой и центрифугировали (15000 × г, , 40 мин, 4 ° C).

Очищенный лизат переносили в стеклянный стакан на бане с ледяной водой, помещенной на магнитную мешалку. Осаждение проводили 35% хлорной кислотой до достижения pH 4,0–4,5. После 5 минут инкубации при 4 ° C при перемешивании молочный раствор центрифугировали (15000 × g , 40 мин, 4 ° C) и супернатант переносили в диализную трубку с MWCO 2 кДа (Roth).Диализ проводили в течение ночи при 4 ° C с использованием 50 мМ аммонийно-ацетатного буфера, pH 4,5. Диализованный раствор центрифугировали (15000 × g, , 40 мин, 4 ° C), фильтровали и очищали с помощью катионообменной хроматографии HiTrap SP FF 5 мл (GE, градиент 0–1 M NaCl). Фракции, показавшие чистоту> 95% по данным SDS-PAGE, были объединены и повторно забуферены (50 мМ Трис pH 8,0, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl 2 ) с использованием центробежного фильтра Amicon ® Ultra-15 3 кДа MWCO. единиц (Millipore).Концентрацию белка рассчитывали по измеренному поглощению A 280 (коэффициенты экстинкции рассчитывали с помощью ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)). В случае Ub определение концентрации белка с использованием поглощения при 280 нм неточно (из-за низкого коэффициента экстинкции (ε)), поэтому для точного определения белка использовались анализы BCA (Thermo Scientific ™) и Bradford (Sigma-Aldrich). определение концентрации. Все варианты Ub были мгновенно заморожены с использованием жидкого азота и хранили при -80 ° C до дальнейшего использования.

Экспрессия и очистка вариантов Ub / SUMO с меткой H
6

Химически компетентный E. coli Rosetta2 (DE3) трансформировали вариантами Ub / SUMO с меткой H 6 в плазмиде pET17b (см. Дополнительную таблицу 3). После восстановления 1 мл среды SOC в течение 1 ч при 37 ° C, клетки культивировали в течение ночи в 50 мл 2 × YT-среды, содержащей ампициллин (100 мкг / мл) и хлорамфеникол (50 мкг / мл), при 37 ° C, 200 об. / Мин. Ночная культура была разбавлена ​​до OD 600 0.05 в 3 л свежей среды 2 × YT с добавлением ампициллина (50 мкг / мл) и хлорамфеникола (25 мкг / мл) и культивирования при 37 ° C, 200 об / мин, до OD 600 = 0,8–1,0. IPTG добавляли до конечной концентрации 1 мМ и экспрессию белка индуцировали в течение 4 часов при 37 ° C. Клетки собирали центрифугированием (4000 × г, , 20 мин, 4 ° C) и ресуспендировали в 20 мл лизирующего буфера / 1 л культуры (20 мМ Трис pH 8,0, 300 мМ NaCl, 30 мМ имидазол, 0,175 мг. / мл ФМСФ, 0,1 мг / мл ДНКазы I и одна таблетка ингибитора протеазы TM (Roche)).Суспензию клеток инкубировали на льду в течение 30 мин и обрабатывали ультразвуком при охлаждении на бане с ледяной водой. Лизированные клетки центрифугировали (15000 × г, , 40 мин, 4 ° C), очищенный лизат добавляли к суспензии Ni-NTA (Jena Bioscience) (1 мл суспензии на 1 л культуры) и смесь инкубировали с перемешивание в течение 1 ч при 4 ° C. После инкубации смесь переносили в пустую пластиковую колонку и промывали 10 объемами промывочного буфера (20 мМ Трис, pH 8,0, 300 мМ NaCl, 30 мМ имидазол). Белок элюировали фракциями по 1 мл промывочным буфером с добавлением 300 мМ имидазола, pH 8.0. Фракции, содержащие белок, были объединены, сконцентрированы и повторно забуферены (50 мМ Трис pH 7,5, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl 2 ) с использованием центробежных фильтров Amicon ® с MWCO 3 кДа (Millipore). Очищенные белки анализировали с помощью 15% SDS-PAGE и масс-спектрометрии. В случае Ub и SUMO определение концентрации белка с использованием поглощения при 280 нм является неточным (из-за их низкого коэффициента экстинкции, поэтому для точного определения концентрации белка использовались анализы BCA (Thermo Scientific ™) и Bradford (Sigma-Aldrich).Варианты Ub и SUMO с меткой H 6 были мгновенно заморожены с использованием жидкого азота и хранили при -80 ° C до дальнейшего использования.

Экспрессия и очистка H
6 -Rap80 варианты 4

Химически компетентный E. coli Rosetta2 (DE3) трансформировали pET28a-H 6 -Rap80 (1–137) -7A- Линкер (для экспериментов pull-down), pET28a-H 6 -Rap80 (35–124) -S18C-C70S-C121S-7A-Linker (для экспериментов по флуоресцентной анизотропии с гибридными цепями) или pET28a-H 6 -Rap80 (79–124) -7A-Linker (для экспериментов по флуоресцентной анизотропии с K63-связанным diUbs) плазмида (см. Дополнительную таблицу 3).После восстановления 1 мл среды SOC в течение одного часа при 37 ° C, клетки культивировали в течение ночи в 50 мл 2 × YT-среды, содержащей канамицин (50 мкг / мл) и хлорамфеникол (50 мкг / мл), при 37 ° C, 200 об. / Мин. Ночную культуру разводили до OD 600 0,05 в 500 мл свежей среды 2 × YT с добавлением канамицина (25 мкг / мл) и хлорамфеникола (25 мкг / мл) и культивировали при 37 ° C при встряхивании (200 об / мин. ) до OD 600 = 0,8. Добавляли IPTG до конечной концентрации 0,5 мМ и индуцировали экспрессию белка в течение 16 часов при 18 ° C.Клетки собирали центрифугированием (4000 × г, , 20 мин, 4 ° C) и ресуспендировали в буфере для лизиса (20 мМ Трис pH 8,0, 300 мМ NaCl, 30 мМ имидазол, 1 мМ TCEP, 0,175 мг / мл PMSF, 0,1 мг / мл ДНКазы I и одна таблетка ингибитора протеазы TM (Roche)). Суспензию клеток инкубировали на льду в течение 30 мин и обрабатывали ультразвуком при охлаждении на бане с ледяной водой. Лизированные клетки центрифугировали (15000 × g, , 40 мин, 4 ° C) и очищенный лизат добавляли к суспензии Ni-NTA (Jena Bioscience) (1 мл суспензии на 1 л культуры), уравновешенной буфером для лизиса. Затем смесь инкубировали при перемешивании в течение 1 ч при 4 ° C. После инкубации смесь переносили в пустую пластиковую колонку и промывали промывочным буфером 10 CV (50 мМ Трис, pH 8,0, 30 мМ имидазол, pH 8,0, 300 мМ NaCl). Белок элюировали фракциями по 1 мл элюирующим буфером (промывочный буфер с добавлением 300 мМ имидазола, pH 8,0). Фракции, содержащие варианты H 6 -Rap80, были объединены и сконцентрированы с использованием центробежного фильтра Amicon ® с MWCO 3 кДа (Millipore) с последующей эксклюзионной хроматографией (SEC) с использованием Superdex S75 10/300 (GE Healthcare). с буфером SEC (50 мМ Трис, pH 7.5, 150 мМ NaCl). Фракции, содержащие варианты H 6 -Rap80, объединяли и концентрировали с помощью центробежных фильтров Amicon ® 3 кДа MWCO (Millipore). Концентрацию белка определяли с помощью анализов BCA (Thermo Scientific ™) и Брэдфорда (Sigma – Aldrich) (поскольку варианты H 6 -Rap80 не содержат ароматических аминокислот с поглощением при 280 нм). Варианты H 6 -Rap80 мгновенно замораживали с использованием жидкого азота и хранили при -80 ° C до дальнейшего использования.

Флуоресцентная маркировка H
6 -Rap80 (79–124) -7A-Linker и H 6 -Rap80 (1–137) -S18C-C70S-C121S-7A-Linker

20 мкМ H 6 -Rap80 (79–124) -7A-Linker / H 6 -Rap80 (1–137) -S18C-C70S-C121S-7A-Linker инкубировали с 100 мкМ малеимида Atto488 (AttoTEC , Кот.No. AD 488) в PBS при 4 ° C. За реакцией мечения следили с помощью ЖХ-МС. Через ~ 30 мин наблюдали количественное мечение, и избыток фторфора гасили 1 мМ DTT (10 мин, 4 ° C). После этого избыток гашеного фторфора удаляли заменой буфера на PBS с использованием центробежных фильтров Amicon ® 10 кДа MWCO (Millipore). Концентрацию Rap80, меченного Atto488, определяли по поглощению Atto488 (500 нм, e max = 9,0 × 10 4 M -1 см -1 ). Меченые варианты H 6 -Rap80 мгновенно замораживали с использованием жидкого азота и хранили при -80 ° C до дальнейшего использования.

Экспрессия и очистка изотопа, меченного H
6 -Rap80 (35–124) -7A-Linker

Равномерно 13 C и / или 15 N-меченых белков экспрессировали в минимальной среде M9 с добавлением 2 г / л гидратированной [U- 13 C] глюкозы и / или 1 г / л 15 N NH 4 Cl и в качестве единственных источников углерода и азота, соответственно.Экспрессию и очистку проводили аналогично описанной выше процедуре. После очистки Ni-NTA изотоп, меченный H 6 -Rap80 (35–124) -7A-Linker был применен к эксклюзионной хроматографии (SEC) с использованием Superdex S75 10/300 (GE Healthcare) с буфером ЯМР (20 мМ Трис, pH 6,8, 150 мМ NaCl). Изотоп, помеченный H 6 -Rap80 (35–124) -7A-Linker, мгновенно замораживали с использованием жидкого азота и хранили при -80 ° C до дальнейшего использования.

Экспрессия и очистка E2-ферментов (GST-Cdc34, GST-Ubc13 и GST-Uev1A)

Химически компетентный E.coli Rosetta2 (DE3) трансформировали pGEX-6P-1-UBE2R1 (кодирование GST-Cdc34), pGEX6P1-UBE2N (кодирование GST-Ubc13) или pGEX6P1-UBE2V1 (кодирование GST-Uev1A). После восстановления 1 мл среды SOC в течение 1 ч при 37 ° C, клетки культивировали в течение ночи в 50 мл 2 × YT-среды, содержащей ампициллин (100 мкг / мл) и хлорамфеникол (50 мкг / мл), при 37 ° C, 200 об. / Мин. Ночную культуру разбавляли до OD 600 0,05 в 1 л свежей среды 2 × YT с добавлением ампициллина (50 мкг / мл) и хлорамфеникола (25 мкг / мл) и культивировали при 37 ° C при встряхивании (200 об / мин. ) до OD 600 = 0.8. Добавляли IPTG до конечной концентрации 0,25 мМ и индуцировали экспрессию белка в течение 18 часов при 20 ° C. Клетки собирали центрифугированием (4000 × г , 20 мин, 4 ° C) и ресуспендировали в буфере для лизиса (50 мМ Трис pH 8,0, 300 мМ сахароза, 50 мМ NaF, 2 мМ DTT, 0,1 мг / мл ДНКазы I. и одна таблетка ингибитора протеазы cOmplete TM (Roche)). Суспензию клеток инкубировали на льду в течение 30 мин и обрабатывали ультразвуком при охлаждении на бане с ледяной водой. Лизированные клетки центрифугировали (15000 × g , 40 мин, 4 ° C), очищенный лизат добавляли к глутатион-сефарозе 4B (GE Healthcare) (0.1 мл взвеси на 100 мл культуры), и смесь инкубировали при перемешивании в течение 1 ч при 4 ° C. После инкубации смесь переносили в пустую пластиковую колонку и промывали 10 объемами промывочного буфера (25 мМ Tris pH 8,5, 400 мМ NaCl, 5 мМ DTT). Белок элюировали фракциями по 1 мл буфером для элюирования (промывочный буфер с добавлением 10 мМ GSH, pH 8,0). Фракции, содержащие GST-меченные E2-ферменты, объединяли и концентрировали с помощью центробежных фильтров Amicon ® с MWCO 10 кДа (Millipore) с последующим SEC с использованием Superdex S75 16/600 (GE Healthcare) с буфером SEC (50 мМ Tris pH 7.5, 150 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ). Фракции, содержащие E2-ферменты, меченные GST, объединяли и концентрировали с помощью центробежных фильтров Amicon ® с подходящим MWCO (Millipore). Концентрацию белка рассчитывали по измеренному поглощению A 280 (коэффициенты экстинкции рассчитывали с помощью ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)). GST-меченные E2-ферменты мгновенно замораживали с использованием жидкого азота и хранили при -80 ° C до дальнейшего использования.

Факультативное расщепление GST выполняли разбавлением E2-ферментов, меченных GST, до 50 мкМ в буфере SEC (50 мМ Tris pH 7.5, 150 мМ NaCl, 1 мМ DTT) с последующим добавлением протеазы PreScission (Sigma – Aldrich, № по каталогу GE27-0843-01). После инкубации при 4 ° C в течение 1 ч добавляли предварительно уравновешенную глутатион-сефарозу 4B (GE Healthcare) для удаления GST и протеазы PreScission. Проходящий поток собирали и наносили на SEC с использованием Superdex S75 16/600 (GE Healthcare) с буфером SEC. Фракции, содержащие немеченые E2-ферменты, объединяли и концентрировали с помощью центробежных фильтров Amicon ® с подходящим MWCO (Millipore).Концентрацию белка рассчитывали по измеренному поглощению A 280 (коэффициенты экстинкции рассчитывали с помощью ProtParam (https://web. expasy.org/protparam/)). E2-ферменты мгновенно замораживали с использованием жидкого азота и хранили при -80 ° C до дальнейшего использования.

Экспрессия и очистка USP2, UCHL3 и SENP2

USP2 9 , UCHL3 10 и SENP2 11 были экспрессированы и очищены, как описано ранее.

Идентификация ортогональных сортаз с помощью анализов гидролиза diUb

Получение diUbs с использованием сортазы

GGK-несущий акцептор Ub (либо с нативным С-концом (например, с нативным С-концом).г. Ub-K6GGK) или с C-концом H 6 -меткой (например, Ub-K6GGK-H 6 ) или с C-концом, совместимым для последующей реакции с ортогональной сортировкой (например, Ub-K6GGK- (PT ) -H 6 )) разбавляли до 20 мкМ в буфере для сортировки (50 мМ Tris pH 7,5, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl 2 ). После этого добавляли 100 мкМ донорного Ub (демонстрирующего мотив распознавания сортировки на его С-конце), за чем следовало добавление 20 мкМ соответствующего мутанта Srt (без метки H 6 ). Инкубацию проводили при 37 ° C в течение 1 часа, когда использовали донорский вариант Ub со спейсером, и 18 часов, когда использовали донорский вариант Ub без спейсера. Транспептидацию, опосредованную сортировкой, останавливали добавлением 200 мкМ фенилвинилсульфона и последующей инкубацией в течение 10 мин при 37 ° C. После этого проводили аффинную очистку с использованием суспензии Ni-NTA (Jena Bioscience), как описано выше. Фракции, содержащие смесь созданного сортазой diUb и непрореагировавшего акцептора Ub, объединяли и концентрировали с использованием центробежных фильтров Amicon ® с MWCO 3 кДа (Millipore).Чтобы удалить непрореагировавший акцептор Ub, SEC проводили с использованием Superdex S75 16/600 (GE Healthcare) с 50 мМ Трис pH 7,5, 150 мМ NaCl. Фракции, содержащие образующийся сортазой diUb, объединяли и концентрировали с использованием центробежных фильтров Amicon ® с MWCO 10 кДа (Millipore). DiUbs мгновенно замораживали с использованием жидкого азота и хранили при -80 ° C до дальнейшего использования.

Этот протокол использовался: (1) для создания всех K6-связанных diUbs для исследования ортогональности сортировки в анализах гидролиза сортировки, (2) для получения доступа к K48- и K63-связанным diUbs для характеристики PT / LPT / AT / LAT-замены, (3) для сборки K48-связанных diUb, используемых для образования гетеротипически связанных triUb, и (4) для получения K63-связанных diUb, которые служат в качестве основы для всех гибридных цепей.

Анализы гидролиза DiUb

K6-связанных diUbs, отображающих различные мотивы сортировки на их сайте связывания (LAT, LPT и LPS), разводили в буфере для сортировки до 40 мкМ с последующим добавлением 10 мкМ различных мутантов сортировки. Реакционные смеси инкубировали при 37 ° C, отбирали 6 мкл образцов в обозначенные моменты времени и гасили добавлением 4-кратного загрузочного буфера SDS. После кипячения при 95 ° C в течение 10 минут и центрифугирования (14000 × g , 5 минут) образцы загружали в 15% гели SDS-PAGE и визуализировали окрашиванием Кумасси.

Получение нативно связанных diUbs

Получение нативно связанных вариантов K48-diUb

Сборку K48-связанных diUb проводили, как описано ранее, с небольшими изменениями 12 . Короче говоря, реакции сборки содержали 50 нМ H 6 -UBE1 (Boston Biochem, Cat. No. E-304-050), 4,5 мкМ GST-Cdc34 и различные концентрации мутантов Ub (как показано на дополнительном рисунке 9). . Реакции инкубировали при 37 ° C в течение обычно 16 ч в реакционном буфере diUb (50 мМ Трис, pH 7.5, 10 мМ MgCl 2 , 0,6 мМ DTT, 10 мМ АТФ). После инкубации разводят в промывочном буфере для уменьшения общей концентрации DTT и 250 мкл (на мл реакционного объема) суспензии Ni-NTA (Jena Bioscience, уравновешивают промывочным буфером (50 мМ Трис pH 7,5, 150 мМ NaCl, 30 мМ имидазол). ), и смесь инкубировали при перемешивании в течение 1 ч при 4 ° C. После инкубации смесь переносили в пустую пластиковую колонку и промывали 40 CV промывочного буфера для удаления GST-Cdc34, непрореагировавшего дикого Ub, дикого K48-diUb и Ub-K48GGK. Белки, меченные H 6, элюировали во фракциях 0,2 мл промывочным буфером с добавлением 300 мМ имидазола, pH 8,0. Фракции, содержащие смесь желаемого K48-связанного diUb (diUb-A или diUb-B) и оставшихся моноблоков с меткой H 6 (Ub (LAT *) – H 6 и Ub (LPT *) – H 6 ) были объединены и сконцентрированы с использованием центробежных фильтров Amicon ® с MWCO 10 кДа (Millipore). Чтобы удалить оставшиеся моноблоки с меткой H 6 (Ub (LAT *) – H 6 и Ub (LPT *) – H 6 ), SEC была проведена с использованием Superdex S75 16/600 (GE Healthcare) с буфером SEC (50 мМ Трис, pH 7.5, 150 мМ NaCl). Фракции, содержащие желаемые K48-связанные diUbs (diUb-A или diUb-B), объединяли и концентрировали с использованием центробежных фильтров Amicon ® с MWCO 3 кДа (Millipore). Концентрацию белка определяли с помощью анализов BCA (Thermo Scientific ™) и Брэдфорда (Sigma-Aldrich). DiUb-A и diUb-B мгновенно замораживали с использованием жидкого азота и хранили при -80 ° C до дальнейшего использования.

Приготовление вариантов K63-diUb с естественной связью

Сборку diUb, связанных с K63, выполняли, как описано ранее, с небольшими изменениями 13 .Короче говоря, реакции сборки содержали 50 нМ H 6 -UBE1 (Boston Biochem, Cat. No. E-304-050), 2,5 мкМ Ubc13, 2,5 мкМ Uev1A, 600 мкМ Ub (LPT * H) -H. 6 и 400 мкМ Ub мас. Реакции инкубировали при 37 ° C в течение обычно 2 ч в реакционном буфере diUb (50 мМ Tris pH 7,5, 10 мМ MgCl 2 , 0,6 мМ DTT, 10 мМ АТФ). После инкубации реакционную смесь разбавляли промывочным буфером для уменьшения общей концентрации DTT и 250 мкл (на мл реакционного объема) суспензии Ni-NTA (Jena Bioscience, уравновешенной промывочным буфером (50 мМ Трис, pH 7.5, 150 мМ NaCl, 30 мМ имидазол) и смесь инкубировали при перемешивании в течение 1 ч при 4 ° C. После инкубации смесь переносили в пустую пластиковую колонку и промывали 40 CV промывочного буфера для удаления Ubc13, Uev1a, непрореагировавшего Ub wt и K63-diUb. Белки, меченные H 6, элюировали во фракциях 0,2 мл промывочным буфером с добавлением 300 мМ имидазола, pH 8,0. Фракции, содержащие смесь желаемого K63-связанного diUb и оставшегося моноUb с меткой H 6 , объединяли и концентрировали с использованием центробежных фильтров Amicon ® с MWCO 10 кДа (Millipore).Для удаления оставшегося monoUb с меткой H 6 проводили SEC с использованием Superdex S75 16/600 (GE Healthcare) с буфером SEC (50 мМ Tris pH 7,5, 150 мМ NaCl). Фракции, содержащие желаемый K63-связанный diUb, объединяли и концентрировали с использованием центробежных фильтров Amicon ® с MWCO 10 кДа (Millipore). Концентрацию белка определяли с помощью анализов BCA (Thermo Scientific ™) и Брэдфорда (Sigma-Aldrich). K63-diUb мгновенно замораживали с использованием жидкого азота и хранили при -80 ° C до дальнейшего использования.

Создание сложных топологий Ub / Ubl с использованием sortase

Получение K48 / K6-связанного triUb с использованием sortase

Реакцию сортировки для создания triUb проводили, как описано выше для diUbs. Короче говоря, 20 мкМ Ub (LAT) -K48-Ub (LPT) -H 6 (см. Дополнительный рисунок 5) использовали в качестве донорного Ub и 100 мкМ Ub-K6GGK-H 6 использовали в качестве акцептора Ub. . Добавляли Srt5M (20 мкМ, без метки H 6 ) с последующей инкубацией при 37 ° C в течение 1 часа. Аффинная очистка с последующей SEC (50 мМ Трис, pH 7.5, 150 мМ NaCl) использовали для очистки triUb. TriUb мгновенно замораживали с использованием жидкого азота и хранили при -80 ° C. Анализ LC-MS использовали для проверки идентичности triUb. Аналитические анализы образования triUb проводили аналогично. Образцы объемом шесть микролитров отбирали в обозначенные моменты времени и гасили добавлением 4 × загрузочного буфера SDS и кипячением при 95 ° C в течение 10 мин. Образцы загружали в 15% гели SDS-PAGE и визуализировали окрашиванием Кумасси.

Получение гибридных цепей, связанных с AT / PT и LAT / LPT, с использованием Srt2A и Srt5M

Сортазную реакцию для образования гибридных цепей, связанных с AT / PT и LAT / LPT, проводили аналогично тому, как описано выше для diUbs. Короче говоря, использовали 20 мкМ Ub (AT) -K63-Ub (PT) -H 6 / Ub (LAT) -K63-Ub (LPT) -H 6 (см. Дополнительные рисунки 6 и 7). в качестве донора и 100 мкМ SUMO2-KxGGK (без C-концевой метки H 6 , которая была удалена с использованием SENP2) в качестве акцептора. Добавляли Srt5M (20 мкМ, с меткой H 6 ) с последующей инкубацией при 37 ° C. Для очистки гибридных цепей, связанных с AT / PT, через 72 часа при 37 ° C использовали Ni-NTA для удаления непрореагировавших diUb и Srt5M. Концентрированный поток Ni-NTA, содержащий желаемую гибридную цепь и избыток SUMO2-KxGGK, наносили на SEC (50 мМ Трис, pH 7.5, 150 мМ NaCl) для разделения. Фракции, содержащие чистые гибридные цепи (идентифицированные с помощью 15% SDS-PAGE), объединяли и концентрировали с использованием центробежных фильтров Amicon ® с MWCO 10 кДа. Концентрацию белка определяли с помощью анализов BCA (Thermo Scientific ™) и Брэдфорда (Sigma-Aldrich). Гибридные цепи мгновенно замораживали с использованием жидкого азота и хранили при -80 ° C до дальнейшего использования. Анализ LC-MS использовали для проверки идентичности гибридных цепей.

Аналитические анализы образования гибридной цепи выполняли аналогично.Образцы объемом шесть микролитров отбирали в обозначенные моменты времени и гасили добавлением 4 × загрузочного буфера SDS и кипячением при 95 ° C в течение 10 мин. Образцы загружали в 15% гели SDS-PAGE и визуализировали окрашиванием Кумасси.

Получение гибридных цепей wt / LPT с использованием ферментативной сборки и Srt5M

Для получения гибридных цепей wt / LPT 50 мкМ нативно связанного K63-diUb (LPT * H) -H 6 инкубировали с 50 мкМ SUMO2-KxGGK (без C-концевой метки H 6 , которая была удалена с помощью SENP2) в буфере для реакции сортировки с добавлением 500 мкМ NiSO 4 (см. Дополнительный рис.7). Добавляли Srt5M (10 мкМ, с меткой H 6 ) с последующей инкубацией при 37 ° C. После инкубации в течение 1 ч Ni-NTA использовали для удаления непрореагировавших diUb и Srt5M. Концентрированный поток Ni-NTA, содержащий желаемую гибридную цепь, diUb без С-концевой H 6 -метки и SUMO2-KxGGK, наносили на SEC (50 мМ Tris pH 7,5, 150 мМ NaCl) для разделения. Фракции, содержащие чистые гибридные цепи (идентифицированные с помощью 15% SDS-PAGE), объединяли и концентрировали с использованием центробежных фильтров Amicon ® с MWCO 10 кДа.Концентрацию белка определяли с помощью анализов BCA (Thermo Scientific ™) и Брэдфорда (Sigma-Aldrich). Гибридные цепи мгновенно замораживали с использованием жидкого азота и хранили при -80 ° C до дальнейшего использования. Анализ LC-MS использовали для проверки идентичности гибридных цепей.

Аналитические анализы для исследования влияния селективного тушения нуклеофилов с помощью NiSO 4 были выполнены аналогично. Образцы объемом шесть микролитров отбирали в обозначенные моменты времени и гасили добавлением 4 × загрузочного буфера SDS и кипячением при 95 ° C в течение 10 мин.Образцы загружали в 15% гели SDS-PAGE и визуализировали окрашиванием Кумасси.

Получение разветвленных три / пентаубов с использованием сортировки

Получение разветвленных три / пентаубов осуществляли по тому же протоколу, который описан выше для реакций сортировки. Короче говоря, 5 или 10 мкМ Ub-Kx / KyGGK-H 6 (в случае препаративной сборки Ub-K11 / K48GGK- (LPT) -H 6 ) использовали в качестве акцептора и 100 мкМ Ub (LAT) (или 50 мкМ K48-diUb (LAT *) – H 6 (diUb-B) в случае сборки pentaUb) в качестве донора.Добавляли Srt2A (10 или 20 мкМ, без метки H 6 ) и смесь инкубировали при 37 ° C в течение 1 часа. Ni-NTA использовали для удаления непрореагировавшего Ub (LAT) и Srt2A. Элюат Ni-NTA, содержащий желаемый разветвленный triUb, а также два промежуточных продукта diUb и Ub-Kx / KyGGK- (LPT *) – H 6 , наносили на SEC (50 мМ TRIS pH 7,5, 150 мМ NaCl) для разделение. Фракции, содержащие чистые разветвленные цепи triUb (идентифицированные 15% SDS-PAGE), объединяли и концентрировали с использованием центробежных фильтров Amicon ® с MWCO 10 кДа.Концентрацию белка определяли, как описано выше. Разветвленный triUb мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C до дальнейшего использования. Анализ LC-MS использовали для проверки идентичности разветвленного triUb.

Аналитические анализы образования разветвленных triUbs / pentaUbs выполняли, как описано выше.

Получение K48-связанного tetraUb с использованием сортазы

Сборку K48-связанного tetraUb проводили аналогично тому, как описано выше для реакций сортазы.Взятые вместе, 10 мкМ diUb-B использовали в качестве донора и 20 мкМ diUb-A в качестве акцептора (см. Дополнительный рисунок 9). Добавляли Srt2A (5 мкМ, без метки H 6 ) с последующей инкубацией при 37 ° C в течение 3 часов. Ni-NTA использовался для удаления Srt2A. Элюат Ni-NTA, содержащий желаемый тетраUb, связанный с K48, а также два diUb, наносили на SEC (50 мМ TRIS pH 7,5, 150 мМ NaCl) для разделения. Фракции, содержащие чистые цепи тетраUb, связанные с K48 (идентифицированные с помощью 15% SDS-PAGE), объединяли и концентрировали с использованием Amicons ® (10 кДа MWCO).Концентрацию белка определяли, как описано выше. K48-связанный tetraUb мгновенно замораживали с использованием жидкого азота и хранили при -80 ° C до дальнейшего использования. Анализ LC-MS использовали для проверки идентичности K48-связанного tetraUb.

Аналитические анализы образования K48-связанного tetraUb выполняли, как описано выше.

Сайт-специфическая модификация sfGFP со сложной архитектурой Ub

Зарядка сложных архитектур на sfGFP была выполнена с 20 мкМ sfGFP-N150GGK-H 6 в качестве акцептора и 10 мкМ разветвленного triUb / K48-связанного tetraUb в качестве донора.Добавляли Srt2A (5 мкМ, без метки H 6 ) с последующей инкубацией при 37 ° C. SDS-PAGE анализ выполняли, как описано выше.

Анализы Pull-down

Анализы Pull-down с GST-Tab2-NZF и GST-hHR23A-UBA2

Анализы Pull-down проводили, как описано ранее 14 . Вкратце, 30 мкг GST-меченного Tab2-NZF или hHR23A-UBA2 инкубировали с 30 мкл 50% взвеси глутатион-сефарозы 4B (GE Healthcare), предварительно уравновешенной буфером с понижающим давлением (50 мМ Tris pH 7. 5, 150 мМ NaCl, 2 мМ ДТТ, 0,1% НП-40) в течение 1 ч при 4 ° C. Затем шарики промывали четыре раза вытяжным буфером (4000 × г, , 2 мин, 4 ° C) с последующим добавлением 7 мкг соответствующих K48- или K63-связанных diUbs в общем объеме 50 мкл ( K48-связанные diUbs в случае hHR23A-UBA2 и K63-связанные diUbs в случае Tab2-NZF). После инкубации при 4 ° C в течение 16 ч шарики шесть раз промывали 100 мкл нисходящего буфера с последующим добавлением 50 мкл 1 × буфера Лэммли и анализом SDS-PAGE.

Rap80 pull-down анализы

H 6 -Rap80 (1–137) -7A-Linker (20 мкг) инкубировали со 100 мкл 50% суспензии Ni-NTA агарозы (Jena Bioscience), уравновешенной вытяжкой. -низкий буфер (PDB, 50 мМ TRIS pH 7,5, 150 мМ NaCl, 2 мМ TCEP, 0,1% NP-40) при 4 ° C в течение 1 ч и затем трижды промыт PDB (4000 × г , 2 мин, 4 ° С). После этого 50% (об. / Об.) Суспензия была получена с использованием PDB. К 30 мкл суспензии Ni-NTA загружают Rap80 (1–137) ,3. Добавляли 5 мкМ по-разному связанных гибридных цепей и соответствующие контроли (wt Ub, K63-diUb, созданный Srt2A, и SUMO2 wt) в общем объеме 50 мкл. После инкубации в течение 1 ч при 4 ° C шарики пять раз промывали 100 мкл PDB с последующим добавлением 50 мкл 1 × буфера Лэммли. После кипячения при 95 ° C в течение 10 минут и центрифугирования (14000 × g , 10 минут) образцы загружали в 15% гели SDS-PAGE и визуализировали путем окрашивания Кумасси. Окрашенные кумасси полосы Rap80 и разрушенные гибридные цепи трех независимых экспериментов с PD анализировали денситометрически с использованием программы ImageJ 1.48t (Уэйн Расбанд, Национальные институты здравоохранения, США, http://imagej.nih.gov/ij). Относительные эффективности PD рассчитывали путем нормализации денситометрического значения разорванных гибридных цепей к денситометрическому значению Rap80.

K

D определение по анизотропии флуоресценции

Эксперименты проводились на флуоресцентном спектрометре Jasco FP-8500, оборудованном поляризаторами (Jasco). Монохроматоры возбуждения и испускания были установлены на 490 нм и 520 нм.

Измерения K48- и K63-связанных diUbs проводили в 25 мМ фосфате натрия, pH 7.4, 150 мМ NaCl, 5 мМ β-меркаптоэтанол, 1 мМ ЭДТА, 0,005% Твин 20. Измерения гибридных цепей проводили в буфере ЯМР (20 мМ Трис, pH 6,8, 100 мМ NaCl, 4 мМ ДТТ). Общий объем кюветы 60 мкл. Концентрация меченных Atto488 вариантов Rap80 поддерживалась постоянной на уровне 300 нМ для всех измерений. Вся обработка данных проводилась с использованием программного обеспечения KaleidaGraph (Synergy Software, Reading, UK). K D определяли с использованием модели одного сайта связывания и средних значений и планок погрешностей (s.г) были рассчитаны в трех разных экспериментах ( n = 3).

DUB assays

USP2 / UCHL3 разбавляли реакционным буфером DUB (25 мМ Трис pH 7,5, 150 мМ NaCl, 10 мМ DTT) и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут для активации. После этого 200 нМ USP2 / UCHL3 добавляли к 20 мкМ вариантам Ub, демонстрируя различные мотивы сортировки на их С-концах, за которыми следовала метка H 6 . В обозначенные моменты времени отбирали 6 мкл образцов и гасили добавлением 4-кратного загрузочного буфера SDS.После кипячения при 95 ° C в течение 10 мин образцы загружали в SDS-PAGE и визуализировали окрашиванием Кумасси. Спектроскопия ЯМР

Данные ЯМР

собирали на спектрометре Bruker Avance III 900 МГц, оборудованном криогенным зондом. Определение химического сдвига резонансов основной цепи для Rap80 (35–124) было выполнено на основе гетероядерных экспериментов, таких как 1H-15N-HSQC, HNCACB, (H) CC (CO) NH, HNCO, HN (CA) CO 56 . ЯМР-спектры обрабатывали с использованием NMRPipe 57 и анализировали с помощью CcpNMR Analysis 2.4,2 58 .

ЯМР эксперименты были записаны в 20 мМ Трис pH 6,8, 100 мМ NaCl, 4 мМ DTT и 10% D2O при 298 К. Определение химического сдвига основной цепи, hetNOE и эксперимент титрования были выполнены при 180, 90 и 10 мкМ, соответственно. . Эксперименты по титрованию с Rap80 (35–124) и гибридными цепями SUMO2-diUb были выполнены в виде серии разведений, где сначала измеряли эталонную и последнюю точку титрования (1: 1), а затем использовали для создания 0,5: 1 и Точки титрования 0,25: 1.

Сводка отчетов

Дополнительная информация о дизайне исследования доступна в Сводке отчетов по исследованиям природы, связанной с этой статьей.

Рош Наука о жизни | Зонды и универсальная библиотека зондов

Мультиплексные анализы

Мультиплексные анализы с универсальными анализами эталонных генов ProbeLibrary

Используйте универсальные контрольные гены ProbeLibrary вместе с Universal ProbeLibrary, чтобы легко количественно определить уровни экспрессии интересующего гена человека, мыши или крысы по отношению к эндогенному контрольному гену в двухцветном анализе.Доступны три анализа эталонных генов для человека (G6PDH, GAPD и ACTB-ген), 2 для мыши (каждый ACTB- и GAPD-ген).

Каждый универсальный анализ эталонного гена ProbeLibrary предоставляет специально разработанный зонд эталонного гена UPL с 12 элементами и соответствующую пару праймеров, специфичных для эталонного гена, в отдельной пробирке. Зонд промаркирован LightCycler®Yellow 555 на 5-м конце и темным красителем-гасителем около 3-го конца, что позволяет проводить двухцветные анализы вместе со стандартными зондами UPL, которые помечены FAM.Зонды эталонного гена UPL могут быть обнаружены с помощью инструментов ПЦР в реальном времени с фильтрами возбуждения от 470 до 530 нм и фильтрами излучения от 550 до 610 нм. В мультиплексных анализах стандартный фильтр FAM или SYBR ® Green I используется в качестве первого канала для обнаружения меченных FAM зондов UPL для интересующего гена, а также более длинноволновый фильтр излучения (обычно следующий возможный фильтр излучения перемещается на более длинные волны, например, 560 нм или 568 нм) используется в качестве второго канала для обнаружения зондов эталонного гена UPL.

Мультиплексные ПЦР-анализы

для целевого гена и эталонного гена UPL разработаны с помощью программного обеспечения ProbeFinder в Центре разработки анализов с высокой степенью успеха, превышающей 90%. Если для выбранного контрольного гена не найдено подходящих анализов (из перечисленных), ProbeFinder SW предлагает двухцветные анализы с одним или несколькими другими контрольными генами из списка.

Создание мультиплексных анализов так же просто, как создание моноплексных анализов: когда вы выбираете опцию мультиплексирования в Интернете, ProbeFinder спроектирует несколько анализов UPL для интересующего вас гена.В то же время каждый анализ подвергается in silico ПЦР-тестированию , чтобы убедиться, что он может быть объединен с одним (или несколькими) анализами эталонных генов UPL для соответствующего организма.

Идентификация функционального стыковочного сайта в домене LRR Rpn1 для белка домена UBA-UBL Ddi1 | BMC Biology

  • 1.

    Hershko A: Роль убиквитин-опосредованного протеолиза в контроле клеточного цикла. Curr Opin Cell Biol. 1997, 9: 788-799.10.1016 / S0955-0674 (97) 80079-8.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 2.

    Вембар С., Бродский Дж .: Шаг за шагом: деградация, связанная с эндоплазматическим ретикулумом. Nat Rev Mol Cell Biol. 2008, 9: 944-957. 10.1038 / nrm2546.

    PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

  • 3.

    Thrower J, Hoffman L, Rechsteiner M, Pickart C: Распознавание протеолитического сигнала полиубиквитина.EMBO J. 2000, 19: 94-102. 10.1093 / emboj / 19.1.94.

    PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

  • 4.

    Pierce N, Kleiger G, Shan S, Deshaies R: Обнаружение последовательного полиубиквитилирования в миллисекундной шкале времени. Природа. 2009, 462: 615-619. 10.1038 / природа08595.

    PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

  • 5.

    Rock KL, Gramm C, Rothstein L, Clark K, Stein R, Dick L, Hwang D, Goldberg AL: ингибиторы протеасомы блокируют деградацию большинства клеточных белков и образование пептидов, представленных в молекулах MHC класса I. Клетка. 1994, 78: 761-771. 10.1016 / S0092-8674 (94) -6.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 6.

    van Nocker S, Sadis S, Rubin D, Glickman M, Fu H, Coux O, Wefes I, Finley D, Vierstra R: белок, связывающий мультиубиквитиновые цепи, Mcb1 является компонентом протеасомы 26S в организме человека. Saccharomyces cerevisiae и играет несущественную, специфичную для субстрата роль в обмене белков.Mol Cell Biol. 1996, 16: 6020-6028.

    PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

  • 7.

    Husnjak K, Elsasser S, Zhang N, Chen X, Randles L, Shi Y, Hofmann K, Walters K, Finley D, Dikic I: субъединица протеасомы Rpn13 представляет собой новый рецептор убиквитина. Природа. 2008, 453: 481-488. 10.1038 / природа06926.

    PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

  • 8.

    Lam YA, Lawson TG, Velayutham M, Zweier JL, Pickart CM: протеасомная субъединица АТФазы распознает сигнал деградации полиубиквитина. Природа. 2002, 416: 763-767. 10.1038 / 416763a.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 9.

    Chen L, Shinde U, Ortolan T, Madura K: Убиквитин-ассоциированные (UBA) домены в Rad23 связывают убиквитин и способствуют ингибированию сборки мультиубиквитиновой цепи. EMBO Rep. 2001, 2: 933-938. 10.1093 / embo-reports / kve203.

    PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

  • 10.

    Уилкинсон С., Сигер М., Хартманн-Петерсен Р., Стоун М., Уоллес М., Семпл С., Гордон С. Белки, содержащие домен UBA, способны связываться с мультиубиквитиновыми цепями. Nat Cell Biol. 2001, 3: 939-943. 10.1038 / ncb1001-939.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 11.

    Бертолает Б., Кларк Д., Вольф М., Уотсон М., Хенце М., Дивита Г., Рид С. Домены UBA белков, индуцируемых повреждением ДНК, взаимодействуют с убиквитином. Nat Struct Biol. 2001, 8: 417-422. 10.1038 / 87575.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 12.

    Фунакоши М., Сасаки Т., Нишимото Т., Кобаяши Х .: Бутоньерные дрожжи Dsk2p – это полиубиквитин-связывающий белок, который может взаимодействовать с протеасомой. Proc Natl Acad Sci USA. 2002, 99: 745-750.10.1073 / pnas.012585199.

    PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

  • 13.

    Ван X, Хуанг Л.: Определение динамических взаимодействующих компонентов белковых комплексов с помощью количественной масс-спектрометрии. MolCell Proteomics. 2008, 7: 46-57.

    Артикул Google Scholar

  • 14.

    Каплун Л., Циркин Р., Бахрат А., Шабек Н., Иванцив Ю., Раве Д.: индуцируемый повреждением ДНК белок UbL-UbA Ddi1 участвует в опосредованной Mec1 деградации эндонуклеазы Ho.Mol Cell Biol. 2005, 25: 5355-5362. 10.1128 / MCB.25.13.5355-5362.2005.

    PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

  • 15.

    Эльзассер С., Гали Р., Швиккарт М., Ларсен С., Леггетт Д., Меллер Б., Фенг М., Тбинг Ф., Диттмар Г., Финли Д.: Субъединица протеасомы Rpn1 связывает убиквитин-подобные белковые домены. Nat Cell Biol. 2002, 4: 725-730. 10.1038 / ncb845.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 16.

    Fu H, Lin Y, Fatimababy A: Протеасомное распознавание убиквитилированных субстратов. Trends Plant Sci. 2010, 15: 375-386. 10.1016 / j.tplants.2010.03.004.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 17.

    Matiuhin Y, Kirkpatrick DS, Ziv I., Kim W., Dakshinamurthy A, Kleifeld O, Gygi SP, Reis N, Glickman MH: Экстрапротеасомный Rpn10 ограничивает доступ полиубиквитин-связывающего белка Dsk2 к протеасомам. Mol Cell. 2008, 32: 415-425.10.1016 / j.molcel.2008.10.011.

    PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

  • 18.

    Zhang D, Chen T, Ziv I, Rosenzweig R, Matiuhin Y, Bronner V, Glickman MH, Fushman D: Вместе Rpn10 и Dsk2 могут служить в качестве датчика длины цепи полиубиквитина. Mol Cell. 2009, 36: 1018-1033. 10.1016 / j.molcel.2009.11.012.

    PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

  • 19.

    Канг Й., Фосслер Р., Диаз-Мартинез Л., Винтер Н., Кларк Д., Уолтерс К.: UBL / UBA рецепторные белки убиквитина связывают общую тетраубиквитиновую цепь. J Mol Biol. 2006, 356: 1027-1035. 10.1016 / j.jmb.2005.12.001.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 20.

    Verma R, Oania R, Graumann J, Deshaies R: Рецепторы мультиубиквитиновой цепи определяют уровень селективности субстрата в системе убиквитин-протеасома. Клетка. 2004, 118: 99-110.10.1016 / j.cell.2004.06.014.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 21.

    Fôrster F, Lasker K, Nickell S, Sali A, Baumeister W: К интегрированной структурной модели протеасомы 26S. Протеомика клеток Mol. 2010, 9: 1666-1677. 10.1074 / mcp.R000002-MCP201.

    PubMed Central Статья PubMed Google Scholar

  • 22.

    Никелл С., Бек Ф., Шерес С., Коринек А., Форстер Ф., Ласкер К., Михалах О. Н., Надь И., Сали А. Понимание молекулярной архитектуры протеасомы 26S.Proc Natl Acad Sci USA. 2009, 106: 11943-11947. 10.1073 / pnas.0

    1106.

    PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

  • 23.

    Бон С., Бек Ф., Саката Э., Вальцтоени Т., Бек М., Эберсолд Р., Форстер Ф., Баумейстер В., Никелл С. Структура протеасомы 26S из Schizosaccharomyces pombe при субнанометрическом разрешении. Proc Natl Acad Sci USA. 2010, 107: 20992-20997. 10.1073 / pnas.1015530107.

    PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

  • 24.

    Saeki Y, Saitoh A, Toh-e A, Yokosawa H: Убиквитин-подобные белки и Rpn10 играют кооперативные роли в убиквитин-зависимом протеолизе. Biochem Biophys Res Commun. 2002, 293: 986-992. 10.1016 / S0006-291X (02) 00340-6.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 25.

    Мюллер Т., Фейгон Дж .: Структурные детерминанты связывания убиквитин-подобных доменов с протеасомой. EMBO J. 2003, 22: 4634-4645. 10.1093 / emboj / cdg467.

    PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

  • 26.

    Диас-Мартинес Л., Канг Й., Уолтерс К., Кларк Д.: Дрожжевые белки UBL-UBA выполняют частично повторяющиеся функции в контроле клеточного цикла. Cell Div. 2006, 1: 28-10. 1186 / 1747-1028-1-28.

    PubMed Central Статья PubMed Google Scholar

  • 27.

    Kim I, Mi K, Rao H: Множественные взаимодействия rad23 предполагают механизм доставки убиквитилированного субстрата, важный для протеолиза.Mol Biol Cell. 2004, 15: 3357-3365. 10.1091 / mbc.E03-11-0835.

    PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

  • 28.

    Fisher RI, Bernstein SH, Kahl BS, Djulbegovic B, Robertson MJ, de Vos S, Epner E, Krishnan A, Leonard JP, Lonial S: многоцентровое исследование фазы II бортезомиба у пациентов с рецидивирующей или рефрактерной мантией клеточная лимфома. J Clin Oncol. 2006, 24: 4867-4874. 10.1200 / JCO.2006.07.9665.

    Артикул PubMed Google Scholar

  • 29.

    Richardson PG, Sonneveld P, Schuster MW, Irwin D, Stadtmauer EA, Facon T, Harousseau JL, Ben-Yehuda D, Lonial S, Goldschmidt H: бортезомиб или дексаметазон в высоких дозах при рецидиве множественной миеломы. N Engl J Med. 2005, 352: 2487-2498. 10.1056 / NEJMoa043445.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 30.

    Кобе Б., Каджава А: богатый лейцином повтор как мотив узнавания белка. Curr Opin Struc Biol. 2001, 11: 725-732.10.1016 / S0959-440X (01) 00266-4.

    Артикул CAS Google Scholar

  • 31.

    Effantin G, Rosenzweig R, Glickman M, Steven A: Электронно-микроскопические доказательства в поддержку альфа-соленоидных моделей протеасомных субъединиц Rpn1 и Rpn2. J Mol Biol. 2009, 386: 1204-1211. 10.1016 / j.jmb.2009.01.039.

    PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

  • 32.

    Каява А: Какие кривые-соленоиды ?. J Biol Chem. 2002, 277: 49791-49798. 10.1074 / jbc.M204982200.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 33.

    Lupas A, Baumeister W, Hofmann K: повторяющаяся последовательность в субъединицах протеасомы 26S и циклосомы 20S (комплекс, способствующий анафазе). Trends Biochem Sci. 1997, 22: 195-196. 10.1016 / S0968-0004 (97) 01058-Х.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 34.

    Сигер М., Хартманн-Петерсен Р., Уилкинсон С., Уоллес М., Самеджима И., Тейлор М., Гордон С. Взаимодействие комплекса, стимулирующего анафазу / циклосома и белковые комплексы протеасомы, с белками, связывающими мультиубиквитиновую цепь. J Biol Chem. 2003, 278: 16791-16796. 10.1074 / jbc.M208281200.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 35.

    Saeki Y, Sone T, Toh-e A, Yokosawa H: Идентификация убиквитин-подобных белков-связывающих субъединиц 26S протеасомы.Biochem Biophys Res Comm. 2002, 296: 813-819. 10.1016 / S0006-291X (02) 02002-8.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 36.

    Леггетт Д., Ханна Дж., Бородовский А., Кросас Б., Шмидт М., Бейкер Р., Уолц Т., Плоег Г., Финли Д.: Множественные ассоциированные белки регулируют структуру и функцию протеасом. Mol Cell. 2002, 10: 495-507. 10.1016 / S1097-2765 (02) 00638-Х.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 37.

    Stone M, Hartmann-Petersen R, Seeger M, Bech-Otschir D, Wallace M, Gordon C: Uch3 / Uch47 – главный деубиквитинирующий фермент, связанный с протеасомой 26 S в делящихся дрожжах. J Mol Biol. 2004, 344: 697-706. 10.1016 / j.jmb.2004.09.057.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 38.

    Verma R, Chen S, Feldman R, Schieltz D, Yates J, Dohmen J, Deshaies RJ: Протеасомная протеомика: идентификация нуклеотид-чувствительных белков, взаимодействующих с протеасомами, с помощью масс-спектрометрического анализа аффинно очищенных протеасом.Mol Biol Cell. 2000, 11: 3425-3439.

    PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

  • 39.

    Фоуден Л., Ричмонд М.: Замена пролина азетидин-2-карбоновой кислотой во время биосинтеза белка. Biochim Biophys Acta. 1963, 71: 459-461.

    Артикул CAS Google Scholar

  • 40.

    Saeki Y, Toh-e A, Kudo T., Kawamura H, Tanaka K: Множественные протеасомы, взаимодействующие с протеасомами, способствуют сборке дрожжевой регуляторной частицы 19S.Клетка. 2009, 137: 900-913. 10.1016 / j.cell.2009.05.005.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 41.

    Эльзассер С., Чандлер-Милителло Д., Мюллер Б., Ханна Дж., Финли Д.: Rad23 и Rpn10 служат альтернативными рецепторами убиквитина для протеасомы. J Biol Chem. 2004, 279: 26817-26822. 10.1074 / jbc.M404020200.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 42.

    Fu H, Sadis S, Rubin DM, Glickman M, van Nocker S, Finley D, Vierstra RD: Связывание мультиубиквитиновой цепи и деградация белка опосредуются отдельными доменами внутри 26 S субъединицы протеасомы Mcb1. J Biol Chem. 1998, 273: 1970-1981. 10.1074 / jbc.273.4.1970.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 43.

    Xie Y, Varshavsky A: RPN4 является лигандом, субстратом и регулятором транскрипции протеасомы 26S: цепь отрицательной обратной связи.Proc Natl Acad Sci USA. 2001, 98: 3056-3061. 10.1073 / pnas.071022298.

    PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

  • 44.

    Ju D, Wang L, Mao X, Xie Y: Гомеостатическая регуляция протеасомы через Rpn4-зависимую цепь обратной связи. Biochem Biophys Res Commun. 2004, 321: 51-57. 10.1016 / j.bbrc.2004.06.105.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 45.

    Matiuhin Y, Kirkpatrick D, Ziv I, Kim W, Dakshinamurthy A, Kleifeld O, Gygi S, Reis N, Glickman M: Extraproteasomal Rpn10 ограничивает доступ полиубиквитин-связывающего белка Dsk2 к протеасоме. Mol Cell. 2008, 32: 415-425. 10.1016 / j.molcel.2008.10.011.

    PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

  • 46.

    Герреро С., Миленкови Т., Прюль Н., Кайзер П., Хуанг Л.: Характеристика сети взаимодействия протеасом с использованием стратегии группы тегов на основе QTAX и анализа сети взаимодействия белков.Proc Natl Acad Sci. 2008, 105: 13333-13338. 10.1073 / pnas.0801870105.

    PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

  • 47.

    Medicherla B, Kostova Z, Schaefer A, Wolf D: Геномный скрининг идентифицирует Dsk2p и Rad23p как важные компоненты ER-ассоциированной деградации. EMBO Rep. 2004, 5: 692-697. 10.1038 / sj.embor.7400164.

    PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

  • 48.

    Лю Ц., ван Дайк Д., Ли И, Эндрюс Б., Рао Х. Скрининг летальности синтетических доз по всему геному выявляет несколько путей, которые требуют функционирования убиквитин-связывающих белков Rad23 и Dsk2. BMC Biol. 2009, 7: 75-10.1186 / 1741-7007-7-75.

    PubMed Central Статья PubMed Google Scholar

  • 49.

    Иванцив Ю., Каплун Л., Циркин-Голдин Р., Шабек Н., Раве Д. Уникальная роль белка UbL-UbA Ddi1 в обороте комплексов SCFUfo1.Mol Cell Biol. 2006, 26: 1579-1588. 10.1128 / MCB.26.5.1579-1588.2006.

    PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

  • 50.

    Bertolaet BL, Clarke DJ, Wolff M, Watson MH, Henze M, Divita G, Reed SI: домены UBA белков, индуцируемых повреждением ДНК, взаимодействуют с убиквитином. Nat Struct Mol Biol. 2001, 8: 417-422. 10.1038 / 87575.

    Артикул CAS Google Scholar

  • 51.

    Чандра А., Чен Л., Лян Х., Мадура К. Сборка протеасом влияет на взаимодействие с убиквитинированными белками и факторами челнока. J Biol Chem. 2010, 285: 8330-8339. 10.1074 / jbc.M109.076786.

    PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

  • 52.

    Fatimababy A, Lin Y, Usharani R, Radjacommare R, Wang H, Tsai H, Lee Y, Fu H: Межвидовая дивергенция основных путей узнавания убиквитилированных субстратов для протеолиза, опосредованного убиквитином / 26S протеасомами.FEBS J. 2010, 277: 796-816. 10.1111 / j.1742-4658.2009.07531.x.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 53.

    Ghaboosi N, Deshaies R: условный мутант дрожжей E1 блокирует путь убиквитин-протеасома и показывает роль конъюгатов убиквитина в нацеливании Rad23 на протеасому. Mol Biol Cell. 2007, 18: 1953-1963. 10.1091 / mbc.E06-10-0965.

    PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

  • 54.

    Hiyama H, Yokoi M, Masutani C, Sugasawa K, Maekawa T., Tanaka K, Hoeijmakers JHJ, Hanaoka F. Взаимодействие hHR23 с S5a. J Biol Chem. 1999, 274: 28019-28025. 10.1074 / jbc.274.39.28019.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 55.

    Walters KJ, Kleijnen MF, Goh AM, Wagner G, Howley PM: Структурные исследования взаимодействия между белками семейства убиквитина и субъединицей протеасомы S5aÜ. Биохимия. 2002, 41: 1767-1777.10.1021 / bi011892y.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 56.

    Li S, Armstrong C, Bertin N, Ge H, Milstein S, Boxem M, Vidalain P, Han J, Chesneau A, Hao T: карта интерактивной сети многоклеточных C. elegans. Наука. 2004, 303: 540-543. 10.1126 / science.10.

    PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

  • 57.

    Longtine M, Mckenzie A, Demarini D, Shah N, Wach A, Brachat A, Philippsen P, Pringle J: Дополнительные модули для универсального и экономичного удаления и модификации генов на основе ПЦР в Saccharomyces cerevisiae. Дрожжи. 1998, 14: 953-961. 10.1002 / (SICI) 1097-0061 (199807) 14:10 <953 :: AID-YEA293> 3.0.CO; 2-U.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 58.

    Kleijnen M, Roelofs J, Park S, Hathaway N, Glickman M, King R, Finley D: Стабильность протеасомы может регулироваться аллостерически посредством задействования ее протеолитических активных сайтов.Nat Struct Mol Biol. 2007, 14: 1180-1188. 10.1038 / nsmb1335.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 59.

    Elsasser S, Schmidt M, Finley D: Характеристика протеасомы с использованием нативного гель-электрофореза. Meth Enzymol. 2005, 398: 353-363.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 60.

    Verma R, Oania R, Fang R, Smith GT, Deshaies RJ: Cdc48 / p97 опосредует УФ-зависимый оборот РНК Pol II.Mol Cell. 2011, 41: 82-92. 10.1016 / j.molcel. 2010.12.017.

    PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar

  • 61.

    Verma R, Deshaies R: Анализ деградации и деубиквитинирования убиквитинированного субстрата с помощью очищенных протеасом 26S. Meth Enzymol. 2005, 398: 391-399.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 62.

    Wisniewski J, Zougman A, Mann M: Комбинация фракционирования на основе FASP и StageTip позволяет проводить углубленный анализ протеома мембраны гиппокампа.J Proteome Res. 2009, 8: 5674-5678. 10.1021 / pr8n.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

  • 63.

    Lee J, Sweredoski M, Graham R, Kolawa N, Smith G, Hess S, Deshaies R: Устойчивый репертуар человеческих комплексов убиквитин-лигазы SCF не требует постоянного конъюгации Nedd8. Протеомика клеток Mol. 2010, 10: M110.006460

    Google Scholar

  • 64.

    Cox J, Mann M: MaxQuant обеспечивает высокую скорость идентификации пептидов, индивидуальную точность измерения масс в диапазоне частей на миллиард и количественное определение протеома в масштабах всего протеома. Nat Biotechnol. 2008, 26: 1367-1372. 10.1038 / nbt.1511.

    Артикул CAS PubMed Google Scholar

    • Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

    Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

    Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

    • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
    • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
    • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
    • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
    • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

    Почему этому сайту требуются файлы cookie?

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

    Что сохраняется в файле cookie?

    Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

    Как правило, в cookie-файлах может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

    Ремни – – MILLER P950DQC / UBL DuraFlex Python Ultra Universal (Large / X-Large) Синяя привязь на все тело: одинарное D-образное кольцо

    Ремни MILLER P950DQC / UBL Blue Universal (Large / X-Large) DuraFlex Python Ultra соответствуют своему названию, ремни MILLER Ultra легко надеваются, они обеспечивают непревзойденный комфорт и свободу передвижения, сохраняя при этом безопасность рабочего и сокращая усталость. Python Ultra оснащен фрикционными пряжками плечевого ремня, подпругой пряжкой и гладкими быстроразъемными пряжками для нагрудных и ножных ремней, эти пряжки блокируются, как ремень безопасности, для легкого надевания и оснащены механизмом освобождения с двумя язычками для предотвращения случайного Подкладка с D-образным кольцом на спине Comfort-Touch Back разработана из специально плетеной, дышащей ткани, которая обеспечивает больший комфорт и ориентирует привязь для быстрого надевания без путаницы. плечевые ремни с профилированными краями для сведения к минимуму возможного дискомфорта в области шеи и плеч, когда пользователь должен носить пояс для инструментов.Высокопрочная, устойчивая к истиранию лямка с прочной, водоотталкивающей пеной высокой плотности будет долго противостоять погодным условиям. Доступные размеры: Small / Medium, Universal и 2X-Large. Цвет синий. Продана каждая.

    Характеристики:

  • Номинальный вес до 400 фунтов
  • Быстроразъемные пряжки для ног и груди
  • Заднее D-образное кольцо Comfort-Touch
  • Лента из нейлона с тефлоновым покрытием HT
  • Комфорт по всему периметру
  • Уникальная конструкция с тремя типами рабочих лямок

    Трубчатые плечевые ремни с мягкой подкладкой:

    Плечевые ремни представляют собой мягкую конструкцию из мягкой ткани, которая сводит к минимуму возможное раздражение в области шеи и плеч, снижая стресс, особенно если рабочий носит пояс для инструментов.

    Ремни для туловища DuraFlex Webbing:

    Тесьма DuraFlex растягивается при движении тела для большей подвижности и уменьшения утомляемости.

    Неэластичные набедренные ремни для ног:

    Неэластичная нейлоновая тесьма легкая и прочная.

    • Условная деградация SDE2 с помощью пути правила Arg / N-End регулирует стрессовую реакцию в репликационных вилках | Исследование нуклеиновых кислот

    Аннотация

    Множественные пути противодействуют стрессу репликации ДНК для предотвращения геномной нестабильности и туморогенеза.Недавно идентифицированный SDE2 человека представляет собой белок наблюдения за геномом, регулируемый PCNA, зажимом ДНК и фактором процессивности в ответвлениях репликации. Здесь мы показываем, что расщепление SDE2 после его убиквитиноподобного домена генерирует Lys-SDE2 Ct , C-концевой фрагмент SDE2, несущий N-концевой остаток Lys. Lys-SDE2 Ct представляет собой короткоживущий физиологический субстрат протеолитического пути правила Arg / N-конца, в котором убиквитинлигазы UBR1 и UBR2 опосредуют деградацию. Правило Arg / N-конца и сегрегаза VCP / p97 UFD1-NPL4 взаимодействуют, способствуя зависимой от фосфорилирования, связанной с хроматином деградации Lys-SDE2 Ct при повреждении UVC.Напротив, клетки, экспрессирующие устойчивый к деградации мутант K78V, Val-SDE2 Ct , не могут индуцировать фосфорилирование RPA и образование одноцепочечной ДНК, что приводит к дефектам в обходе PCNA-зависимых повреждений ДНК и остановке восстановления вилки. Вместе наше исследование проясняет ранее недооцененную ось, связывающую правило Arg / N-конца и p97-опосредованный протеолиз с ответом на стресс репликации, работая вместе, чтобы сохранить целостность репликационной вилки.

    ВВЕДЕНИЕ

    Достижение точной дупликации генома – сложная задача для механизма репликации ДНК.Неспособность преодолеть различные препятствия, блокирующие репликацию, вызывает нарушения синтеза ДНК, которые в совокупности называются стрессом репликации (1). Повышенное образование аберрантных структур репликационной вилки из-за потери путей ответа на репликационный стресс приводит к пагубным мутационным событиям, которые сильно связаны с нестабильностью генома и туморогенезом (2). Ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA) – это фактор процессивности, который играет критическую роль в координации репликации ДНК, направляя репликативные ДНК-полимеразы в ответвлениях репликации (3).Постоянный стресс репликации, например, из-за повреждений, вызванных ультрафиолетом C (UVC), блокирующими репликацию, приводит к разъединению PCNA-ассоциированной полимеразной и геликазной активностей, что приводит к накоплению одноцепочечной ДНК (оцДНК) рядом с вилками репликации ( 4). В свою очередь, оцДНК, покрытая RPA, активирует путь ATR-CHK1 для устранения стресса репликации и сохранения целостности репликационной вилки (5). Обширная платформа RPA-ssDNA привлекает комплекс RAD6 / RAD18 убиквитин (Ub) E2 / E3-лигаз для моноубиквитинирования PCNA (PCNA-Ub) на застрявших вилках и дополнительно задействует специализированные полимеразы, которые позволяют обходить повреждения ДНК посредством синтеза трансфузионной ДНК (TLS). , форма механизма толерантности к повреждению ДНК, регулируемая посттрансляционной модификацией PCNA (6).В сочетании с ремоделированием застопорившихся вилок, такими как реверсирование репликационной вилки, эти вышеупомянутые пути в совокупности способствуют восстановлению остановившихся вилок и обеспечивают эффективное продвижение S-фазы против стресса репликации (7).

    Регулируемая деградация белка, опосредованная убиквитин-протеасомной системой (UPS), контролирует гомеостаз белка и, таким образом, регулирует множественные клеточные процессы. Правило N-конца действует в UPS посредством распознавания белков, содержащих N-концевые (Nt) сигналы деградации, называемых N-дегронами, N-распознаванием.N-распознаватели представляют собой специализированные лигазы убиквитина E3, которые полиубиквитинируют и разрушают субстраты с помощью N-дегронов через протеасомы (8). Таким образом, это определяет период полужизни субстратов правила N-конца, который зависит от идентичности уникального остатка Nt. Ветвь правила Arg / N-конец нацелена на специфические неацетилированные и предпочтительно положительно заряженные остатки Nt, такие как Lys и Arg, которые экспонируются после протеолитического расщепления или генерируются посредством последовательных ферментативных модификаций, таких как дезаминирование и аргинилирование (9) (дополнительный рисунок S1A).Хотя современное понимание правила N-конца расширилось за последние три десятилетия и выявило его роль в широком диапазоне клеточных процессов, только несколько субстратов были идентифицированы у высших эукариот, включая человека. Следовательно, идентичность регуляторных сигнальных путей протеолиза, опосредованного правилом N-конца, остается плохо изученной, особенно в контексте ответа на повреждение ДНК (DDR).

    Учитывая необходимость того, чтобы факторы надзора за геномом функционировали в тесном контакте с ДНК, для точной настройки их клеточных уровней и активности путем протеолиза требуется дополнительный регуляторный элемент для извлечения субстратов из хроматина или макромолекулярных комплексов. Все больше данных свидетельствует о том, что валозинсодержащий белок (VCP) / сегрегаза p97 вносит свой вклад в такой процесс, используя АТФ для извлечения и разворачивания связанных с хроматином убиквитинированных субстратов, тем самым координируя регулируемый оборот факторов репликации и репарации ДНК протеасомой (10). . Важно отметить, что нарушение связанной с p97 деградации хроматина (CAD) и стойкое накопление его субстратов приводит к так называемому белково-индуцированному стрессу хроматина (PICHROS) и нарушает целостность генома, тем самым подчеркивая важность CAD в осуществлении пространственно-временной регуляции. белкового оборота и клеточной функции для поддержания генома (11).

    Мы недавно идентифицировали новый белок наблюдения генома у человека, SDE2, который регулирует репликационный стрессовый ответ посредством CAD на репликационных вилках (12). Активность SDE2 регулируется PCNA-зависимым эндолитическим расщеплением его Nt Ub-подобного домена (UBL), который генерирует C-концевой (Ct) полипептид SDE2, SDE2 Ct , необходимый для противодействия стрессу репликации. Мы продемонстрировали, что своевременная деградация SDE2 Ct на хроматине необходима для сохранения целостности репликационной вилки, тем самым обеспечивая прогрессию S-фазы и выживание клеток.Однако остается неясным, как динамика протеолиза SDE2 способствует его функции в модулировании репликационного стрессового ответа и целостности вилки. В этом исследовании мы идентифицируем протеолитическую ось Arg / N-end rule-p97 как новый регулятор деградации и функции SDE2. Мы демонстрируем, что своевременная деградация SDE2 Ct в ответвлениях репликации необходима для создания платформы RPA-ssDNA, необходимой для обхода PCNA-зависимых повреждений ДНК против UVC-индуцированного стресса репликации, тем самым способствуя восстановлению остановившихся вилок и прогрессированию S-фазы.Мы показываем, что ATR-зависимое фосфорилирование Ct SDE2 усиливает его взаимодействие с UFD1, адаптером комплекса p97, способствуя выделению SDE2 Ct из хроматина. Наше исследование устанавливает ранее недооцененную связь между передачей сигналов стресса репликации и правилом Arg / N-конца, чье соединение контролирует CAD факторов надзора за геномом для защиты застрявших вилок и уменьшения стресса репликации. Мы предполагаем, что регулируемая деградация SDE2 может быть ключевым детерминантом для динамики реплисомы и для ремоделирования факторов DDR на вилках репликации, чтобы оптимизировать ответы на стресс репликации.

    МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

    Культуры клеток и плазмидные конструкции

    клеточных линий HeLa, U2OS и 293T были получены из Американской коллекции культур тканей (ATCC). Эмбриональные клетки мыши UBR1 – / – и UBR2 – / – стали добрым подарком от Александра Варшавского (Калифорнийский технологический институт). Клетки U2OS Flp-In T-REx были любезным подарком от Даниэля Дюроше (Исследовательский институт Луненфельда-Таненбаума). Клетки культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко, с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина / стрептомицина, следуя стандартным условиям и процедурам культивирования. Человеческая кДНК SDE2 была приобретена у Open Biosystems / Dharmacon (MHS1010–97228092), в то время как полноразмерная или удаленная кДНК была амплифицирована с помощью ПЦР и субклонирована в модифицированные векторы pcDNA3-Flag, pcDNA3-HA (Invitrogen) или pEGFP-C1 ( Клонтех). Точечные мутации вводили с помощью набора для сайт-направленного мутагенеза QuikChange II XL (Agilent Technologies) и подтверждали секвенированием ДНК. Устойчивый к siRNA кДНК SDE2 была получена путем мутации четырех нуклеотидов целевой последовательности для siRNA oligo SDE2–1 (acgCcaGtggccGacCaaa).Стабильные клеточные линии получали ретровирусной трансдукцией конструкций pMSCV-SDE2-Flag с использованием 8 мкг / мл полибрена (Sigma-Aldrich) с последующей селекцией с использованием 2 мкг / мл пуромицина. Вирусы были получены из клеток 293Т, котрансфицированных с помощью pMSCV-SDE2-Flag, pCMV-Gag / Pol и pCMV-VSV-G. Человеческая UBR1 Полноразмерная кДНК была сконструирована путем генного синтеза и клонирована в pcDNA3-GFP KpnI-BamHI (Genscript). Для стабилизации вставки плазмиды размножали и поддерживали на низком уровне копий в штамме CopyCutter EPI400 (Lucigen), и репликацию плазмиды индуцировали перед приготовлением ДНК.Человеческая UFD1 кДНК была получена от Open Biosystems (MHS6278–202828389) и клонирована в pcDNA3-HA.

    Плазмиды и трансфекция миРНК

    Плазмиду

    трансфекцию проводили с использованием GeneJuice (Millipore) в соответствии с протоколами производителя. Дуплексы миРНК трансфицировали при 25 нМ с использованием Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen). Информацию о последовательности миРНК можно найти в дополнительной таблице S1.

    Антитела и химические вещества

    Антитела

    , использованные в этом исследовании, перечислены в дополнительной таблице S2.Химические вещества, использованные в этом исследовании, перечислены в дополнительной таблице S3.

    Вестерн-блоттинг и фракционирование

    Клетки лизировали в буфере NETN300 (1% NP40, 300 мМ NaCl, 0,1 мМ EDTA и 50 мМ Трис [pH 7,5]) с добавлением коктейля ингибиторов протеазы (Roche) и коктейлем ингибиторов фосфатазы (Thermo Fisher). Лизаты разделяли с помощью SDS-PAGE, переносили на PVDF-мембраны (Millipore) и антитела детектировали с помощью метода усиленной хемилюминесценции.Некоторые изображения иммуноблоттинга были получены с помощью системы визуализации iBright CL1000 (Thermo Fisher). Субклеточное фракционирование выполняли, как описано ранее (13). Вкратце, клетки лизировали с использованием буфера цитоскелета (CSK) (10 мМ Трис [pH 6,8], 100 мМ NaCl, 300 мМ сахарозы, 3 мМ MgCl 2 , 1 мМ EGTA, 1 мМ EDTA и 0,1% Triton X-100. ) в течение 5 мин на льду. После центрифугирования при 1500 g в течение 5 минут супернатант (S) отделяли от осадка (P), и осадок последовательно лизировали в PBS и 2-кратном кипящем буфере для лизиса (50 мМ Tris-Cl [pH 6.8], 2% SDS и 850 мМ β-меркаптоэтанол).

    Генерация U2OS Flp-In

    TM T-REx TM ячеек

    Клеточная линия остеосаркомы U2OS-хозяина стабильно экспрессирует Tet-репрессор (T-REx) и несет единственный локус FRT (Flp-In). Конструкцию SDE2 клонировали с использованием системы Gateway ™ и котрансфицировали плазмидой pOG44, кодирующей рекомбиназу Flp (Invitrogen), для создания клеточных линий U2OS Flp-In T-REx. КДНК SDE2, сначала клонированная в вектор двойной селекции pENTR ™ 3C (Invitrogen), была ранее мутирована по четырем нуклеотидам, чтобы стимулировать ее устойчивость к олиго siRNA SDE2–1.Для создания мутации K78V использовали сайт-направленный мутагенез. LR Clonase TM II затем использовали для переноса кДНК SDE2 в нашу плазмиду-адресат, любезно предоставленную доктором Jiricny (Университет Цюриха, Швейцария), и построили на векторе pcDNA ™ 5 / FRT / TO (Invitrogen). SDE2, экспрессируемый из этого вектора, имеет одну метку Strep и одну метку HA на своем С-конце. Через 48 часов после трансфекции с использованием X-tremeGENE ™ 9 (Roche) начинали отбор гигромицина, и стабильно трансфицированные клетки восстанавливались через 4 недели.Затем использовали доксициклин в дозе 10 нг / мл для стимулирования экспрессии трансгена, как правило, после подавления эндогенного SDE2 путем трансфекции siRNA олиго-1 SDE2 с использованием Lipofectamine RNAiMAX, как указано.

    Окрашивание BrdU для обнаружения оцДНК

    Клетки выращивали на покровных стеклах и инкубировали с 10 мкМ BrdU в течение 48 ч перед УФ-облучением. Клетки пермеабилизировали PBS / 0,3% Triton X-100 в течение 3 минут при 4 ° C с последующей фиксацией 4% параформальдегидом в течение 10 минут при комнатной температуре.После блокирования 5% BSA клетки сначала инкубировали с 1: 300 анти-BrdU (BU-1) в течение 2 часов, а после промывания PBS инкубировали с 1: 1000 козьим антимышиным IgG Alexa Fluor 488 в течение 45 минут в 1% BSA. После повторной промывки PBS покровные стекла устанавливали с использованием среды для закрепления, содержащей DAPI (Vector Lab), и анализировали с помощью конфокального микроскопа Leica TCS SP8 X. Скорректированная интенсивность общей флуоресценции клеток (CTCF) была количественно определена и рассчитана с помощью Fiji и проанализирована с помощью Prism (GraphPad).

    Расчесывание волокон ДНК

    Экспоненциально растущие клетки сначала метили 50 мкМ CldU в течение 20 мин при 37 ° C. После трех промывок PBS клетки обрабатывали или не обрабатывали 30 Дж / м 2 UV-C (UV Stratalinker 1800, Stratagene) и дополняли средой, содержащей 250 мкМ IdU, в течение 30 минут при 37 ° C. Затем были приготовлены волокна ДНК с использованием набора для экстракции ДНК FiberPrep и системы молекулярного расчесывания FiberComb (Genomic Vision, Франция), как рекомендовано поставщиком. Вкратце, клетки собирали трипсинизацией, подсчитывали, а затем 400000 клеток промывали PBS перед заливкой в ​​агарозу с низкой температурой плавления и заливкой в ​​форму для пробок.После полного затвердевания пробки расщепляли протеиназой К. в течение ночи. На следующий день пробки тщательно промывали перед тем, как вскоре растопить и расщепить агаразой в течение ночи. Затем полученные ДНК-волокна наносили на силанизированные покровные стекла (Genomic Vision, Франция). Расчесанные покровные стекла обезвоживали, и ДНК денатурировали в течение 8 мин с использованием 0,5 М NaOH в 1 М NaCl. Во время последующего процесса окрашивания все инкубации проводились во влажных условиях при 37 ° C. Короче говоря, покровные стекла сначала блокировали 1% BSA в течение 30 минут, затем оба первичных антитела разводили вместе в 1% BSA (крысиные моноклональные анти-BrdU для CldU, 1:25, и мышиные моноклональные анти-BrdU для IdU, 1: 5) и инкубировали 1 ч.После промывания покровных стекол 0,05% PBS-Tween (PBS-T) вторичные антитела разводили вместе в 1% BSA (козий антикрысиный Alexa Fluor 594 и козий антимышиный Alexa Fluor 488, 1: 100) и инкубировали в течение 45 мин. После промывки покровных стекол PBS-T и их обезвоживания их помещали на предметные стекла микроскопа, используя ProLong ™ Gold Antifade, и сушили в течение ночи. Затем были визуализированы волокна ДНК с помощью конфокального микроскопа Leica TCS SP8 X и проанализированы с помощью программного обеспечения Fiji.

    Статистический анализ

    Тест Стьюдента t был использован для оценки статистической значимости наших результатов с помощью Prism (GraphPad). Непарные тесты t были выполнены с 95% доверительным интервалом с использованием двусторонних значений P , если не указано иное. Для анализа расчесывания ДНК был проведен U-тест Манна – Уитни с 95% доверительным интервалом с использованием Prism (GraphPad).

    РЕЗУЛЬТАТЫ

    Природный фрагмент SDE2 как субстрат пути правила Arg / N-конца

    Наша предыдущая работа показала, что первые 77 остатков человеческого SDE2 включают UBL с консервативной Ct-последовательностью Gly 76 –Gly 77 , которая идентична двум последним остаткам Ub, и что клеточные деубиквитинирующие ферменты (DUBs ) мог расщепить SDE2 сразу после Gly 77 (12) (рис. 1A).Полученный в результате Ct-фрагмент SDE2, названный SDE2 Ct , был метаболически нестабилен в основанной на циклогексимиде (CHX) погоне, в то время как полноразмерный мутант SDE2, не расщепляемый посредством мутации G76A / G77A (GA), был длинным – жили (рисунок 1B и дополнительный рисунок S1B). Таким образом, расщепление SDE2 необходимо для деградации SDE2 Ct . Поскольку последним был Lys-SDE2 Ct , несущий Nt-Lys, дестабилизирующий остаток в пути правила Arg / N-конца, мы спросили, может ли человеческий Lys-SDE2 Ct быть ранее не описанным физиологическим субстратом этого пути.Действительно, мутация Lys 78 в небольшой гидрофобный остаток, такой как Val или Ala, внутри полноразмерного SDE2, меченного флагом на С-конце, привела к сильной стабилизации мутанта в дополнение к его повышенному уровню в начале CHX. гнаться. (Рисунок 1C и дополнительный рисунок S1C и S1D). Мутант K78V был полностью расщеплен с образованием Val-SDE2 Ct , и его клеточные уровни были сопоставимы с уровнями мутанта GA, что указывает на то, что при расщеплении нарушается деградация (дополнительная фигура S1E).Кроме того, деградация SDE2 Ct ингибировалась маскированием Lys 78 SDE2 Ct либо с помощью HA-tag, либо Met (рис. 1D и E и дополнительный рисунок S1F).

    Рисунок 1. Расщепление

    SDE2 обнажает N-дегрон, необходимый для правила Arg / N-конец. ( A ) Схема расщепления SDE2 по диглициновому мотиву, генерирующему SDE2 Ct с экспонированным Nt Lys 78 . ( B ) Клетки U2OS, экспрессирующие SDE2-Flag дикого типа (WT) или G76A / G77A полной длины, обрабатывали 50 мкг / мл циклогексимида (CHX) или ДМСО (носитель) в течение указанного времени и анализировали с помощью вестерн-блоттинга ( WB).( C – E ) CHX chase и WB анализ клеток U2OS, экспрессирующих (C) WT или K78V полноразмерный SDE2-Flag, или (D) WT полноразмерный SDE2-Flag по сравнению с HA-SDE2 Ct -Flag, или (E) WT полноразмерный SDE2-Flag по сравнению с Met-SDE2 Ct -Flag. Показаны репрезентативные изображения, а графики количественной оценки можно найти на дополнительном рисунке S1.

    Рисунок 1. Расщепление

    SDE2 обнажает N-дегрон, необходимый для правила Arg / N-конца. ( A ) Схема расщепления SDE2 по диглициновому мотиву, генерирующему SDE2 Ct с экспонированным Nt Lys 78 .( B ) Клетки U2OS, экспрессирующие SDE2-Flag дикого типа (WT) или G76A / G77A полной длины, обрабатывали 50 мкг / мл циклогексимида (CHX) или ДМСО (носитель) в течение указанного времени и анализировали с помощью вестерн-блоттинга ( WB). ( C – E ) CHX chase и WB анализ клеток U2OS, экспрессирующих (C) WT или K78V полноразмерный SDE2-Flag, или (D) WT полноразмерный SDE2-Flag по сравнению с HA-SDE2 Ct -Flag, или (E) WT полноразмерный SDE2-Flag по сравнению с Met-SDE2 Ct -Flag. Показаны репрезентативные изображения, а графики количественной оценки можно найти на дополнительном рисунке S1.

    Подобно другим сигналам деградации, распознаваемым системой Ub, N-дегроны как минимум двудольные. Их второй детерминантой является остаток Lys субстрата, участок связанной с субстратом цепи поли-Ub, который продуцируется N-узнавающей Ub-лигазой после ее связывания с дестабилизирующим Nt-остатком субстрата (8,14). Мы обнаружили, что разрушение Lys 94 , ближайшего к N-концу Lys-SDE2 Ct , стабилизировало Lys-SDE2 Ct , что указывает на то, что этот остаток Lys является одним из основных (хотя и не обязательно основным). sole) сайты полиубиквитинирования (дополнительный рисунок S1G).

    В совокупности эти результаты предполагают, что расщепление SDE2 ниже его UBL обнажает Lys, дестабилизирующий остаток, и что Lys-SDE2 Ct (далее сокращенно SDE2 Ct ) является физиологическим субстратом Arg / N- конец пути правила.

    UBR1 и UBR2 опосредуют деградацию SDE2

    Ct фрагмента

    UBR1 и UBR2, два 47% идентичных N-распознавания, лежат в основе основной части деградации субстратов правила Arg / N-конца в клетках млекопитающих (8).Опосредованное миРНК истощение либо UBR1 (с использованием двух независимых олигонуклеотидов миРНК), либо UBR2 значительно стабилизировало SDE2 Ct в клетках остеосаркомы человека U2OS, хотя дефицит UBR1 приводит к более сильному влиянию на деградацию Ct SDE2 (рис. 2A и B). Кроме того, совместное истощение как UBR1, так и UBR2 привело к практически полному прекращению деградации эндогенного и экзогенного SDE2 Ct (рисунки 2C и дополнительные рисунки S2A и B). Аналогичные результаты были получены с использованием ранее полученных клеточных линий Ubr1 – / – и Ubr2 – / – мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) (15, 16) (фигура 2D и дополнительная фигура S2C).Чтобы дополнительно подтвердить наши результаты, мы сгенерировали UBR1 нокаутных клеток U2OS с использованием CRISPR / Cas9 (дополнительный рисунок S2D). Множественные клоны UBR1 – / – клеток продемонстрировали повышенную стабильность SDE2 Ct -Flag (рис. 2E), а нокдаун UBR2 в UBR1 – / – клеток предотвратил деградацию обоих. эндогенный и экзогенный SDE2 Ct почти полностью (рисунок 2F и дополнительный рисунок S2E).Различная сила дефицита UBR1 в различных экспериментальных условиях может быть связана с острым нокдауном по сравнению с компенсацией во время клональной селекции нокаутных клеток. Вместе эти результаты на множестве клеточных линий подтверждают идею, что как UBR1, так и UBR2 действуют как первичные ubiquitin E3 лигазы, необходимые для деградации SDE2 Ct в пути правила Arg / N-конца.

    Рисунок 2.

    UBR1 и UBR2 функционируют как N-распознаватель для деградации SDE2 Ct ( A , B ) Клетки U2OS, последовательно трансфицированные указанными олигонуклеотидами миРНК (по сравнению с контролем: CTL) и с полноразмерными SDE2-Flag обрабатывали 50 мкг / мл CHX в течение указанного времени, и уровни SDE2 Ct -Flag анализировали с помощью WB.Уровни Ct SDE2 нормализовали путем контроля загрузки и количественно оценивали с помощью ImageJ (0 часов принимали за 100%). ( C ) Клетки U2OS трансфицировали указанными олигонуклеотидами siRNA и обрабатывали 100 мкг / мл CHX в течение указанного времени, и анализировали эндогенные уровни Ct SDE2 WB. Показаны репрезентативные изображения, а графики количественной оценки можно найти на дополнительном рисунке S2B. ( D ) Указанные MEF, сверхэкспрессирующие SDE2-Flag, подвергали CHX-преследованию для анализа деградации SDE2 Ct -Flag.( E ) SDE2-Flag трансфицировали в независимые U2OS UBR1 CRISPR-нокаут-клоны, и уровни SDE2 Ct -Flag анализировали с помощью WB через 4 ч CHX. WT обозначает клон, трансфицированный пустым вектором. ( F ) U2OS UBR1 – / – Клон 6 был трансфицирован олиго siRNA UBR2 (по сравнению с контролем на фоне WT или UBR1 – / – ), и спад эндогенных уровней SDE2 Ct был контролируется. ( G ) Схема структуры UBR1 человека, изображающая бокс UBR и домен RING.Мутации, представленные в этом исследовании, отмечены звездочками. Выравнивание последовательностей было произведено с помощью ESPript 3. ( H ) (Слева) Поверхность электростатического потенциала бокса UBR, адаптированного из структуры PDB 3NY3, показывающая отрицательно заряженный карман (красный) с пептидом SDE2 Ct N-degron , 78 KGGF 81 . (Справа) элементы распознавания UBR-бокса, образующие водородные связи с N-degron Lys 78 . ( I ) Ко-IP Anti-Flag клеток 293T, коэкспрессирующих SDE2-Flag и HA-tagged UBR box (остатки 1–176) из hUBR1 WT или мутанта.

    Рисунок 2.

    UBR1 и UBR2 функционируют как N-распознаватели для деградации SDE2 Ct ( A , B ) Клетки U2OS, последовательно трансфицированные указанными олигонуклеотидами siRNA (по сравнению с контролем: CTL) и полностью длины. SDE2-Flag обрабатывали 50 мкг / мл CHX в течение указанного времени, и уровни SDE2 Ct -Flag анализировали с помощью WB. Уровни Ct SDE2 нормализовали путем контроля загрузки и количественно оценивали с помощью ImageJ (0 часов принимали за 100%). ( C ) Клетки U2OS трансфицировали указанными олигонуклеотидами siRNA и обрабатывали 100 мкг / мл CHX в течение указанного времени, и анализировали эндогенные уровни Ct SDE2 WB. Показаны репрезентативные изображения, а графики количественной оценки можно найти на дополнительном рисунке S2B. ( D ) Указанные MEF, сверхэкспрессирующие SDE2-Flag, подвергали CHX-преследованию для анализа деградации SDE2 Ct -Flag. ( E ) SDE2-Flag трансфицировали в независимые U2OS UBR1 CRISPR-нокаут-клоны, и уровни SDE2 Ct -Flag анализировали с помощью WB через 4 ч CHX. WT обозначает клон, трансфицированный пустым вектором. ( F ) U2OS UBR1 – / – Клон 6 был трансфицирован олиго siRNA UBR2 (по сравнению с контролем на фоне WT или UBR1 – / – ), и спад эндогенных уровней SDE2 Ct был контролируется.( G ) Схема структуры UBR1 человека, изображающая бокс UBR и домен RING. Мутации, представленные в этом исследовании, отмечены звездочками. Выравнивание последовательностей было произведено с помощью ESPript 3. ( H ) (Слева) Поверхность электростатического потенциала бокса UBR, адаптированного из структуры PDB 3NY3, показывающая отрицательно заряженный карман (красный) с пептидом SDE2 Ct N-degron , 78 KGGF 81 . (Справа) элементы распознавания UBR-бокса, образующие водородные связи с N-degron Lys 78 .( I ) Ко-IP Anti-Flag клеток 293T, коэкспрессирующих SDE2-Flag и HA-tagged UBR box (остатки 1–176) из hUBR1 WT или мутанта.

    Хорошо известно, что семейство N-распознаваний UBR характеризуется атипичным доменом из цинкового пальца, названным боксом UBR на его N-конце, который представляет собой отрицательно заряженный карман, который распознает положительно заряженный N-градус субстрата. (17,18) (Рисунок 2G). Мы выполнили моделирование структуры на основе ранее описанной структуры бокса UBR в комплексе с N-degron и обнаружили, что Lys пептида SDE2 Ct , по прогнозам, будет образовывать водородные связи с отрицательно заряженными боковыми цепями из Asp 118 , Asp . 150 и Asp 153 коробки UBR (19,20) (Рисунок 2H).Мы наблюдали, что GFP-меченный полноразмерный UBR1 связывается с SDE2 Ct в отсутствие и в присутствии повреждения ДНК (дополнительный рисунок S2F), а мутации отрицательно заряженных остатков в боксе UBR в UBR1 отменяют его взаимодействие с SDE2 Ct. , подтверждая, что N-degron SDE2 Ct распознается боксом UBR UBR1 посредством электростатических взаимодействий (рис. 2I). Вместе эти результаты дополнительно подтверждают, что E3-лигаза UBR1 распознает N-степень SDE2 Ct , чтобы запустить деградацию SDE2 Ct .

    Правило Arg / N-конца регулирует деградацию SDE2

    Ct в ответ на облучение UVC

    Ранее мы показали, что SDE2 Ct подвергается деградации в ответ на повреждение UVC (12). Это происходит как с эндогенным, так и с экзогенно экспрессируемым SDE2 Ct , особенно во фракции, обогащенной хроматином, что позволяет предположить, что деградация Ct SDE2 происходит в контексте взаимодействия ДНК (дополнительный рисунок S3A). Делеция предполагаемого ДНК-связывающего домена SAF-A / B, Acinus и PIAS (SAP) SDE2 предотвращает его ассоциацию с хроматином и отменяет его деградацию, что дополнительно подтверждает эту идею (дополнительный рисунок S3B) (12). Таким образом, мы определили, регулирует ли передача сигналов правила N-конца также деградацию SDE2 Ct на хроматине во время репликационного стресса. Действительно, в то время как SDE2 Ct дикого типа (WT) подвергался деградации специфически во фракциях, обогащенных хроматином, после повреждения UVC, мутант K78V не смог этого сделать (фигура 3A и дополнительная фигура S3C). Мы также наблюдали аналогичные результаты дефектной деградации с мутантами K78V, меченными флагом C-конца, или мутантами Ct SDE2 с N-концом, меченными HA (фиг. 3B и C, и дополнительные фиг. S3D и E).Кроме того, совместное истощение UBR1 и UBR2 значительно аннулировало деградацию как эндогенного, так и экзогенного Ct SDE2 в хроматине, подтверждая, что путь правила N-конца необходим для CAD SDE2 Ct после повреждения ДНК (рис. 3D). и дополнительный рисунок S3F и G). Ранее мы показали, что CRL4 CDT2 убиквитин E3 лигаза необходима для зависимой от повреждений деградации SDE2 Ct в хроматине. Интересно, что нокдаун UBR1 и 2, но не CDT2, предотвратил деградацию SDE2 Ct во время погони за CHX, указывая на то, что правило N-конца в первую очередь управляет оборотом SDE2 Ct в нестрессированных клетках (рис. 3E).Напротив, когда мы снизили количество концентраций олиго siRNA для трансфекции, мы наблюдали, что нокдаун как CDT2, так и UBR1 или UBR2 препятствовал деградации SDE2 Ct после повреждения UVC аддитивным образом (рисунок 3F и дополнительный рисунок S3H). Эти результаты показывают, что CAD SDE2 Ct в условиях репликационного стресса может быть инициирован бимодальной активацией правила N-конца и передачи сигнала убиквитина CRL4 CDT2 . Следует отметить, что ранее мы показали, что SDE2 Ct , лишенный классического белка взаимодействия с PCNA (PIP) degron, был способен взаимодействовать с CDT2 через домен SAP (12), предполагая, что зависимая от повреждений деградация Ct SDE2 должна происходить в контекст хроматина, где передача сигналов стресса репликации может регулировать локализацию и / или активность как UBR1 / 2, так и CRL4 CDT2 .

    Рисунок 3.

    Правило N-конца способствует зависимой от повреждений деградации SDE2 Ct . ( A ) Клетки U2OS, экспрессирующие Nt GFP-меченные полноразмерные SDE2 WT или K78V, обрабатывали 40 Дж / м 2 UVC и через 4 часа фракционировали на цитозольные / нуклеоплазматические (S) по сравнению с обогащенными хроматином (P) фракций с последующим анализом ВБ. ( B ) Фракцию P клеток U2OS, экспрессирующих меченый Ct Flag полноразмерный SDE2 WT или K78V и обработанных или не обработанных UVC, анализировали с помощью WB.( C ) Клетки U2OS, экспрессирующие Nt HA-меченый полноразмерный SDE2 или SDE2 Ct , подвергали УФ-облучению, фракционировали и анализировали с помощью анти-SDE2 и анти-HA WB соответственно. ( D ) Клетки U2OS, трансфицированные указанной миРНК, облучили УФС, фракционировали и проанализировали с помощью WB. Уровни SDE2 Ct во фракции P были количественно определены с помощью ImageJ, и оставшийся SDE2 Ct после UVC был определен по сравнению с необработанными. ( E ) Анализ CHX chase и WB клеток U2OS, трансфицированных указанными олигонуклеотидами siRNA и SDE2-Flag.( F ) Клетки U2OS трансфицировали указанной комбинацией олигонуклеотидов siRNA и GFP-SDE2, облучали 40 Дж / м 2 UVC, и фракции P анализировали с помощью WB (блот UBR1 из фракции S). ( G ) Клетки U2OS оставляли необработанными (Unt) или обрабатывали 40 Дж / м 2 UVC (4 часа восстановления), 2 мМ гидроксимочевины (HU) в течение 16 часов, 100 нг / мл митомицина C (MMC) в течение 16 часов или 100 нг / мл камптотецина (CPT) в течение 16 часов, и фракции P анализировали с помощью WB. ( H ) Клетки U2OS предварительно обрабатывали 10 мкМ ингибитором ATR (VE-821) в течение 1 ч, облучали UVC и давали восстановиться в присутствии ингибитора.Эндогенный SDE2 Ct анализировали WB во фракциях P.

    Рисунок 3.

    Правило N-конца способствует зависимой от повреждений деградации SDE2 Ct . ( A ) Клетки U2OS, экспрессирующие Nt GFP-меченные полноразмерные SDE2 WT или K78V, обрабатывали 40 Дж / м 2 UVC и через 4 часа фракционировали на цитозольные / нуклеоплазматические (S) по сравнению с обогащенными хроматином (P) фракций с последующим анализом ВБ. ( B ) Фракцию P клеток U2OS, экспрессирующих меченый Ct Flag полноразмерный SDE2 WT или K78V и обработанных или не обработанных UVC, анализировали с помощью WB.( C ) Клетки U2OS, экспрессирующие Nt HA-меченый полноразмерный SDE2 или SDE2 Ct , подвергали УФ-облучению, фракционировали и анализировали с помощью анти-SDE2 и анти-HA WB соответственно. ( D ) Клетки U2OS, трансфицированные указанной миРНК, облучили УФС, фракционировали и проанализировали с помощью WB. Уровни SDE2 Ct во фракции P были количественно определены с помощью ImageJ, и оставшийся SDE2 Ct после UVC был определен по сравнению с необработанными. ( E ) Анализ CHX chase и WB клеток U2OS, трансфицированных указанными олигонуклеотидами siRNA и SDE2-Flag.( F ) Клетки U2OS трансфицировали указанной комбинацией олигонуклеотидов siRNA и GFP-SDE2, облучали 40 Дж / м 2 UVC, и фракции P анализировали с помощью WB (блот UBR1 из фракции S). ( G ) Клетки U2OS оставляли необработанными (Unt) или обрабатывали 40 Дж / м 2 UVC (4 часа восстановления), 2 мМ гидроксимочевины (HU) в течение 16 часов, 100 нг / мл митомицина C (MMC) в течение 16 часов или 100 нг / мл камптотецина (CPT) в течение 16 часов, и фракции P анализировали с помощью WB. ( H ) Клетки U2OS предварительно обрабатывали 10 мкМ ингибитором ATR (VE-821) в течение 1 ч, облучали UVC и давали восстановиться в присутствии ингибитора.Эндогенный SDE2 Ct анализировали WB во фракциях P.

    Интересно, что деградация SDE2 Ct оказывается наиболее выраженной после облучения УФС по сравнению с другими источниками репликационного стресса, и это совпадает с индукцией моноубиквитинирования PCNA (рис. 3G). Истощение RAD18, лигазы убиквитина E3 для PCNA, не предотвращало деградацию Ct SDE2 , что указывает на то, что деградация Ct SDE2 происходит выше моноубиквитинирования PCNA (дополнительный рисунок S3I).Как сообщалось ранее, другой субстрат правила Arg / N-конца USP1, DUB для PCNA-Ub, проявлял специфическую деградацию при облучении UVC (21) (рис. 3G). Эти результаты указывают на важность правила N-конца в регуляции как USP1, так и SDE2 Ct в связанной с репликацией репарации ДНК, чтобы регулировать уровни PCNA-Ub. Таким образом, мы предположили, что передача сигналов контрольной точки ATR может быть связана с опосредованной N-концевым правилом деградацией Ct SDE2 в ответ на стресс репликации, вызванный поражениями UVC.Примечательно, что обработка клеток ингибитором ATR VE-821 предотвращала эндогенную деградацию SDE2 Ct после облучения UVC (рис. 3H). Эти результаты устанавливают новую связь между передачей сигналов ATR, вызванной стрессом репликации, и протеолитическим путем, регулируемым правилом N-конца.

    Сегрегазный комплекс p97

    UFD1-NPL4 способствует связанной с хроматином деградации SDE2 Ct

    Specific SDE2 Деградация Ct в хроматине после повреждения UVC побудила нас исследовать элемент, который связывает стресс репликации и передачу сигналов правила N-конца в контексте взаимодействия ДНК.Сегрегаза VCP / p97 может быть разумным кандидатом, поскольку она стала критическим фактором для CAD множественной репликации ДНК и белков контрольных точек повреждения (10). Действительно, ингибирование активности p97 с помощью его специфического ингибитора NMS-873 ослабляло деградацию эндогенной деградации Ct SDE2 при облучении UVC (фигура 4A и дополнительная фигура S4A). Мы наблюдали аналогичный антагонистический эффект ингибирования р97 на деградацию как немеченого, так и меченного флагом экзогенного SDE2 Ct (дополнительная фигура S4B).Истощение p97 с использованием независимых олигонуклеотидов siRNA также предотвращало деградацию SDE2 Ct , в частности, во фракции, обогащенной хроматином, после облучения UVC (рис. 4B). Субстратная специфичность p97 определяется его адапторными белками, которые содержат мотивы, взаимодействующие с p97, и убиквитин-связывающие домены. Примечательно, что истощение гибридной деградации убиквитина 1 (UFD1) или белка локализации ядерного белка 4 (NPL4), двух компонентов гетеродимерного адапторного комплекса p97, защищало SDE2 Ct от UVC-индуцированной деградации конкретно на хроматине, указывая на то, что p97 Комплекс UFD1-NPL4 опосредует CAD SDE2 Ct (рис. 4C).Напротив, истощение другого адаптера, UBXN7, необходимого для нацеливания на факторы NER DDB2 и XPC, не повлияло на деградацию SDE2 Ct (22) (дополнительный рисунок S4C). Вместе эти данные показывают, что ось N-end rule-p97 UFD1-NPL4 способствует CAD SDE2 Ct при стрессе репликации, индуцированном UVC.

    Рисунок 4.

    p97 UFD1-NPL4 является посредником CAD SDE2 Ct . ( A ) Клетки U2OS были предварительно обработаны 10 мкМ ингибитором p97 (NMS-873) в течение 1 ч, облучены УФ-излучением и позволили восстановиться в присутствии ингибитора. Эндогенный SDE2 Ct был проанализирован WB. ( B ) Клетки U2OS, трансфицированные двумя независимыми олигонуклеотидами миРНК p97 (по сравнению с CTL), облучали 40 Дж / м 2 UVC, и фракции S / P анализировали с помощью WB. ( C ) Клетки U2OS, трансфицированные указанными олигонуклеотидами миРНК, облучали 40 Дж / м 2 UVC, фракционировали и анализировали с помощью WB. * неспецифический белок, связанный с хроматином. ( D ) Клетки U2OS, экспрессирующие WT, S266A, T319A или S266A / T319A SDE2-Flag, облучали 40 Дж / м 2 UVC, и фракции P анализировали с помощью WB.( E ) Клетки U2OS, экспрессирующие SDE2-Flag, облучали 40 Дж / м 2 UVC, выделенных в присутствии 20 мкМ MG132 в течение 2 часов. Фракцию хроматина подвергали воздействию анти-Flag IP и WB с помощью антител против pSDE2 T319 и Flag. ( F ) Клетки 293T, трансфицированные указанными плазмидами, подвергали анти-Flag IP и WB.

    Рисунок 4.

    p97 UFD1-NPL4 является посредником CAD SDE2 Ct . ( A ) Клетки U2OS были предварительно обработаны 10 мкМ ингибитором p97 (NMS-873) в течение 1 ч, облучены УФ-излучением и позволили восстановиться в присутствии ингибитора.Эндогенный SDE2 Ct был проанализирован WB. ( B ) Клетки U2OS, трансфицированные двумя независимыми олигонуклеотидами миРНК p97 (по сравнению с CTL), облучали 40 Дж / м 2 UVC, и фракции S / P анализировали с помощью WB. ( C ) Клетки U2OS, трансфицированные указанными олигонуклеотидами миРНК, облучали 40 Дж / м 2 UVC, фракционировали и анализировали с помощью WB. * неспецифический белок, связанный с хроматином. ( D ) Клетки U2OS, экспрессирующие WT, S266A, T319A или S266A / T319A SDE2-Flag, облучали 40 Дж / м 2 UVC, и фракции P анализировали с помощью WB.( E ) Клетки U2OS, экспрессирующие SDE2-Flag, облучали 40 Дж / м 2 UVC, выделенных в присутствии 20 мкМ MG132 в течение 2 часов. Фракцию хроматина подвергали воздействию анти-Flag IP и WB с помощью антител против pSDE2 T319 и Flag. ( F ) Клетки 293T, трансфицированные указанными плазмидами, подвергали анти-Flag IP и WB.

    Индуцируемое повреждением SDE2

    Фосфорилирование Ct способствует ассоциации с комплексом p97 UFD1-NPL4 для его деградации

    Затем мы попытались определить механизмы, с помощью которых SDE2 Ct деградирует в зависимости от повреждений.SDE2 содержит два предполагаемых ATM / ATR-опосредованных сайта фосфорилирования S / TQ на Ser 266 и Thr 319 , расположенных в линкерной области между консервативными доменами SDE2 и SAP. О фосфорилировании Thr 319 при УФС-повреждении ранее сообщалось в фосфопротеомическом анализе (23). Поскольку ингибирование ATR снижает деградацию Ct SDE2 , мы предположили, что индуцируемое повреждением фосфорилирование SDE2 Ct может способствовать его деградации. Примечательно, что мутации либо Ser 266 , либо Thr 319 , либо обоих, повышали стационарные уровни SDE2 Ct и значительно ослабляли деградацию SDE2 Ct после облучения UVC, что указывает на то, что фосфорилирование SDE2 Ct способствует его развитию. собственная деградация (рисунок 4D и дополнительный рисунок S4D).Созданное нами фосфоспецифическое антитело было способно распознавать индуцируемый повреждением pThr 319 экзогенного SDE2, обогащенного иммунопреципитацией против Flag (фиг. 4E), которая устраняется при ингибировании мутанта T319A или ATR и удаляется обработкой фосфатазой ( Дополнительный рисунок S4E – G). Чтобы дополнительно определить, как фосфорилирование влияет на деградацию SDE2 Ct , мы исследовали, способствует ли фосфорилирование взаимодействиям с игроками в N-end rule-p97 сигнальной оси. В соответствии с нашей идентификацией гетеродимера UFD1-NPL4 как адаптера для p97-опосредованной деградации Ct SDE2 , мы наблюдали взаимодействие между SDE2 Ct -Flag и HA-UFD1 (Figure 4F). Важно отметить, что мутации сайтов фосфорилирования значительно устраняют коиммунопреципитацию UFD1 с помощью SDE2 Ct , указывая на то, что фосфорилирование SDE2 Ct необходимо для UFD1 для эффективного распознавания SDE2 Ct . В соответствии с этим, ингибирование ATR отменяет это взаимодействие (дополнительный рисунок S4H). Напротив, взаимодействия нефосфорилируемых мутантов SDE2 с UBR1 при повреждении UVC практически не пострадали (дополнительный рисунок S4I). Вместе эти данные предполагают, что ATR-зависимое фосфорилирование SDE2 Ct способствует N-концу зависимого от правил деградации SDE2 Ct за счет усиления взаимодействия SDE2 Ct с комплексом p97 UFD1-NPL4 для облегчения экстракции убиквитинированного SDE2. Ct из хроматина.

    N-конец, зависимая от правил деградация SDE2

    Ct способствует фосфорилированию RPA и восстановлению из застрявших вилок

    Чтобы изучить специфическую роль деградации SDE2 Ct , регулируемой правилом N-конца, в противодействии репликационному стрессу, мы использовали индуцибельную систему Flp-In ™ T – REx ™ для замены эндогенного SDE2 на экзогенный SDE2 WT или K78V. В этой системе кДНК SDE2-HA WT или K78V, устойчивая к siRNA, была интегрирована в конкретный локус в клетках U2OS посредством рекомбинации ДНК, опосредованной Flp-рекомбиназой, в сайте FRT, где экспрессия SDE2-HA индуцируется доксициклином (dox), в то время как эндогенный SDE2 одновременно удаляется siRNA, чтобы «перевернуть» экспрессию (24) (рис. 5A).Эта система позволяет создавать изогенные стабильные клеточные линии, в которых экспрессия белка регулируется до эндогенного уровня. После нокдауна эндогенного SDE2 и индукции dox экзогенного SDE2 Ct -HA WT или K78V мы наблюдали, что белки SDE2 Ct K78V поддерживаются на более высоком уровне, чем белки WT, что указывает на то, что SDE2-HA находится под контролем. правила N-конца (рисунок 5B). В этих условиях экзогенный SDE2 Ct -HA WT был способен полностью дополнять эндогенный SDE2 Ct для фосфорилирования RPA и активации CHK1 после облучения UVC (рис. 5C).Напротив, клетки, экспрессирующие мутант K78V, демонстрировали заметное снижение фосфорилирования RPA по сравнению с «перевернутыми» клетками WT, что указывает на то, что дефектная деградация Ct SDE2 ставит под угрозу загрузку и модификацию RPA при остановившихся вилках репликации (фиг. 5C). Следует отметить, что кинетика фосфорилирования CHK1 не была затронута, это указывает на то, что наблюдаемый фенотип RPA не является следствием глобального дефекта передачи сигналов контрольных точек. Кроме того, индукции экспрессии мутанта K78V на вершине эндогенного SDE2 было достаточно для ослабления фосфорилирования RPA, предполагая, что аберрантное накопление Ct SDE2 препятствует активации RPA и привлечению к остановившимся вилкам (рис. 5D).Мы наблюдали аналогичные результаты нарушения фосфорилирования RPA в «перевернутых» клетках, восстановленных мутантом K78V (дополнительная фигура S5A), и ослабление фосфорилирования RPA после индукции K78V поверх эндогенного SDE2 в клетках Flp-In K78V (дополнительная фигура S5B). .

    Рисунок 5.

    N-конец, зависящий от правил SDE2 Деградация Ct необходима для оптимального фосфорилирования RPA и загрузки в остановившихся вилках репликации. ( A ) Схема генерации клеток Flp-In U2OS.( B ) Валидация системы Flp-In путем индукции экспрессии siRNA-устойчивого (siR) SDE2-HA WT или K78V WT или K78V с использованием 10 нг / мл доксициклина (dox) в течение 72 часов и с помощью siRNA-опосредованного нокдаун за 84 ч. ( C ) Экспрессию SDE2 WT или K78V в клетках Flp-In индуцировали трансфекцией siRNA и индукцией dox, клетки облучали 10 Дж / м 2 UVC, и лизаты, собранные после указанных периодов восстановления, анализировали с помощью WB. . ( D ) Клетки SDE2 K78V Flp-In индуцировали или не индуцировали 10 нг / мл dox в течение 64 часов с последующим УФ-облучением и WB.( E ) Клетки U2OS, стабильно экспрессирующие основанный на MSCV SDE2-Flag siR WT, K78V или K78V + ΔSAP (по сравнению с EV), были облучены 30 Дж / м 2 с последующим 3-часовым восстановлением, и клеточные лизаты были подвергнуты облучению. проанализирован ВБ. ( F ) Клетки U2OS в (E) инкубировали с 2 мМ HU в течение 17 часов, подвергали импульсному воздействию 10 мкМ EdU в течение 30 минут и высвобождали в свежую среду. Клетки собирали в указанные сроки, и прогрессирование клеток EdU + отслеживали с помощью проточной цитометрии. Показан репрезентативный стробирование клеток EdU + на поздней S-фазе.( G ) Представлен процент закрытых клеток, отслеживаемых окрашиванием EdU. Среднее ± SD ( n = 3 независимых эксперимента), * P <0,05 и ** P <0,01 по сравнению с EV, WT или K78V + ΔSAP, непарный двусторонний тест Стьюдента t . ( H ) трансфицированные миРНК клетки U2OS облучали 10 Дж / м 2 UVC, собирали в указанные моменты времени и клеточные лизаты анализировали с помощью WB.

    Рисунок 5.

    N-конец, зависящий от правил SDE2 Деградация Ct необходима для оптимального фосфорилирования RPA и загрузки в остановившихся вилках репликации.( A ) Схема генерации клеток Flp-In U2OS. ( B ) Валидация системы Flp-In путем индукции экспрессии siRNA-устойчивого (siR) SDE2-HA WT или K78V WT или K78V с использованием 10 нг / мл доксициклина (dox) в течение 72 часов и с помощью siRNA-опосредованного нокдаун за 84 ч. ( C ) Экспрессию SDE2 WT или K78V в клетках Flp-In индуцировали трансфекцией siRNA и индукцией dox, клетки облучали 10 Дж / м 2 UVC, и лизаты, собранные после указанных периодов восстановления, анализировали с помощью WB. .( D ) Клетки SDE2 K78V Flp-In индуцировали или не индуцировали 10 нг / мл dox в течение 64 часов с последующим УФ-облучением и WB. ( E ) Клетки U2OS, стабильно экспрессирующие основанный на MSCV SDE2-Flag siR WT, K78V или K78V + ΔSAP (по сравнению с EV), были облучены 30 Дж / м 2 с последующим 3-часовым восстановлением, и клеточные лизаты были подвергнуты облучению. проанализирован ВБ. ( F ) Клетки U2OS в (E) инкубировали с 2 мМ HU в течение 17 часов, подвергали импульсному воздействию 10 мкМ EdU в течение 30 минут и высвобождали в свежую среду. Клетки собирали в указанные сроки, и прогрессирование клеток EdU + отслеживали с помощью проточной цитометрии. Показан репрезентативный стробирование клеток EdU + на поздней S-фазе. ( G ) Представлен процент закрытых клеток, отслеживаемых окрашиванием EdU. Среднее ± SD ( n = 3 независимых эксперимента), * P <0,05 и ** P <0,01 по сравнению с EV, WT или K78V + ΔSAP, непарный двусторонний тест Стьюдента t . ( H ) трансфицированные миРНК клетки U2OS облучали 10 Дж / м 2 UVC, собирали в указанные моменты времени и клеточные лизаты анализировали с помощью WB.

    Чтобы дополнить наши результаты, мы создали независимую систему для замены эндогенного SDE2 на siRNA-устойчивые варианты SDE2, меченные флагом, с помощью трансдукции, опосредованной ретровирусным вектором MSCV (дополнительный рисунок S5C). Интересно, что делеция ДНК-связывающего домена SAP (ΔSAP) в мутанте K78V (K78V ΔSAP) дополнительно стабилизировала белок в стабильных клеточных линиях, что указывает на то, что CAD SDE2 Ct является ключевым последующим этапом его деградации, и что другие протеолитические пути могут сходиться с передачей сигналов p97, способствуя выделению SDE2 Ct из хроматина. Используя эту систему, мы снова показали, что клетки, восстановленные с помощью мутанта K78V после нокдауна SDE2, не могут индуцировать устойчивое фосфорилирование RPA при повреждении UVC без нарушения фосфорилирования CHK1 (дополнительная фигура S5D). После УФ-облучения фосфорилированный RPA присутствовал исключительно во фракции, обогащенной хроматином, которая была аннулирована в клетках, экспрессирующих K78V, подтверждая, что загрузка и фосфорилирование RPA в остановившихся вилках ингибировались из-за дефектной деградации Ct SDE2 (дополнительный рисунок S5E). .Более того, стабильная сверхэкспрессия мутанта K78V на эндогенном фоне SDE2 была достаточной для снижения уровней pRPA, вызванных повреждением UVC, по сравнению с векторным контролем или WT (фиг. 5E). Важно отметить, что делеция домена SAP в мутанте K78V не смогла подавить уровни pRPA, указывая на то, что вредный эффект накопления SDE2 Ct проявляется в контексте ассоциации ДНК (рис. 5E). Точно так же временная сверхэкспрессия мутанта K78A, но не мутанта ΔSAP, снижала UVC-индуцированные уровни pRPA по сравнению с контролем, несмотря на их сходные уровни экспрессии (дополнительный рисунок S5F). Вместе эти данные подтверждают, что N-end rule-mediated SDE2 Ct -degradation облегчает рекрутирование и фосфорилирование RPA в застопорившихся вилках.

    Затем мы исследовали влияние деградации SDE2 по правилу N-конца на развитие клеточного цикла и остановку восстановления вилки с использованием вышеупомянутых стабильных клеток MSCV. Сверхэкспрессия SDE2 Ct дикого типа или мутанта не оказывала значительного влияния на пролиферацию клеток, что измерялось клетками, пересекающими S-фазу с помощью мечения EdU и проточной цитометрии (дополнительный рисунок S5G).Напротив, при оценке после репликационного стресса усиленная экспрессия мутанта K78V, но не WT или K78V ΔSAP, значительно нарушала прогрессию S-фазы (рис. 5F и G). Эти результаты показывают, что нарушение деградации SDE2 Ct предотвращает эффективную репликацию ДНК и остановленное восстановление вилки в условиях репликационного стресса, подчеркивая физиологическую роль правила N-конца в поддержании генома.

    Специфическое подавление pRPA, но не pCHK1, мутантом K78V после стресса репликации предполагает, что подмножество передачи сигналов ATR нарушается из-за дефектной деградации SDE2 Ct .Точно так же нокдаун ETAA1, недавно идентифицированного активатора ATR, который рекрутируется в остановленные вилки через прямое взаимодействие RPA (25, 26), специфически отменяет фосфорилирование RPA при облучении UVC и лечении камптотецином (CPT), в то время как активация pCHK1 практически не затрагивается (рис. 5H). и дополнительный рисунок S5H). Напротив, нокдаун TOPBP1, другого активатора ATR на соединении 5 ’ssDNA-dsDNA свернутых вилок, который работает параллельно с ETAA1, был достаточен для отмены фосфорилирования CHK1.Эти результаты показывают, что аберрантное накопление SDE2 Ct K78V может избирательно нарушать каскад активации ATR, регулируемый ETAA1, активность которого напрямую зависит от генерации платформы ssDNA-RPA вблизи застопорившихся вилок (27).

    SDE2

    Деградация Ct способствует образованию оцДНК и передаче сигналов для обхода повреждений ДНК в остановленных репликационных вилках

    Мы пришли к выводу, что дефект загрузки RPA, наблюдаемый в мутантных клетках K78V, может быть результатом снижения образования оцДНК на остановившихся вилках из-за неправильного клиренса SDE2 Ct в ответ на стресс репликации. Действительно, окрашивание нативным BrdU показало, что перевернутые клетки, экспрессирующие мутант K78V, демонстрируют пониженную генерацию оцДНК в ответ на УФ-облучение по сравнению с клетками, экспрессирующими WT (фиг. 6A и B). Мы наблюдали аналогичные результаты в стабильных клеточных линиях на основе MSCV, экспрессирующих WT, по сравнению с K78V после нокдауна эндогенного SDE2 (дополнительные рисунки S6A и B). Участок оцДНК, покрытый RPA, в остановившихся вилках репликации обеспечивает платформу для рекрутирования лигазы убиквитина E3 RAD18, которая, в свою очередь, моноубиквитинирует PCNA и запускает переключение полимеразы, необходимое для TLS.Субклеточное фракционирование продемонстрировало, что у перевернутых клеток, экспрессирующих мутант K78V, нарушено фосфорилирование RPA и ассоциация RAD18 с хроматином, что совпадает со снижением моноубиквитинирования PCNA, индуцируемого UVC, по сравнению с клетками WT (фигура 6C и дополнительная фигура S6C). Точно так же сниженные уровни фосфорилирования RPA, рекрутирования RAD18 и моноубиквитинирования PCNA наблюдались в основанных на MSCV стабильных клеточных линиях, восстановленных с помощью мутанта K78V (дополнительный рисунок S6D). Сверхэкспрессии мутанта K78A было также достаточно, чтобы противодействовать моноубиквитинированию PCNA после облучения UVC (дополнительный рисунок S6E).Впоследствии восстановление клеток, истощенных по SDE2, мутантом K78V уменьшало образование очагов TLS-полимеразы η до UVC-индуцированных повреждений ДНК как в системах Flp-In, так и в MSCV, что указывает на то, что подавление PCNA-Ub ставит под угрозу переключение на полимеразы TLS. из-за дефекта деградации SDE2 после повреждения, вызванного УФС (рис. 6D и E, а также дополнительный рисунок S6F и G). Зависимое от повреждений формирование Pol η фокусов преимущественно наблюдалось в EdU-меченных S-фазных клетках, что указывает на то, что фокусы в основном индуцировались против связанных с репликацией повреждений ДНК (фигура 6E).Более того, нокдаун UBR1 и UBR2 увеличивал клеточные уровни SDE2 и нарушал UVC-индуцированное фосфорилирование RPA, что повторяет эффект мутанта K78V, хотя UBR1 и UBR2 могут иметь другие неизвестные субстраты N-конца правила, способствующие передаче сигналов стресса репликации (дополнительный рисунок S6H).

    Рисунок 6.

    UVC-индуцированная деградация SDE2 Ct способствует обходу повреждений ДНК в остановившихся репликационных вилках. ( A ) Флиппированные клетки SDE2 WT или K78V инкубировали с 10 мкМ BrdU в течение 48 ч, и наличие оцДНК анализировали с помощью иммуноокрашивания против BrdU в неденатурирующих условиях.Показаны репрезентативные изображения. Масштабная линейка 10 мкм. ( B ) Количественная оценка интенсивности BrdU с использованием Фиджи. Показаны репрезентативные результаты трех независимых экспериментов. * P <0,0001, непарный тест Стьюдента t -тест. ( C ) Перевернутые клетки SDE2 WT или K78V облучали 40 Дж / м 2 UVC и собирали через 4 часа, затем фракционировали и анализировали с помощью WB. * убиквитинированный RAD18 в S. ( D ) Перевернутые клетки WT или K78V были обратно трансфицированы GFP-Pol η на покровных стеклах, предварительно обработаны 10 мкМ EdU в течение 30 минут для маркировки клеток в S-фазе, облученные 40 Дж / м 2 UVC, и через 2 ч фокусы GFP-Pol η визуализировали с помощью иммунофлуоресценции против GFP. Показаны репрезентативные изображения GFP-Pol η из клеток EdU + (Alexa Fluor 647; фиолетовый). Масштабные линейки 10 мкм. ( E ) Количественная оценка фокусов GFP-Pol η из клеток EdU +, EdU– или всего (как EdU +, так и EdU-). Foci + указывает на> 20 определенных очагов GFP-Pol η. Среднее ± стандартное отклонение ( n = 3),> 100 клеток на условие. * P <0,01 по сравнению с WT, непарный тест Стьюдента t . ( F ) Классифицированные экспериментальные условия для расчесывания ДНК и репрезентативные изображения дорожек волокон ДНК. (G) Количественная оценка текущих развилок, гусениц только с меткой IdU (запуск нового источника) и только с меткой CldU (остановка вилки). Среднее ± стандартное отклонение ( n = 3),> 100 треков на условие. * P = 0,0154 ** P = 0,0210, непарный тест Стьюдента t -тест. ( H ) SDE2-Flag siR WT или K78V-экспрессирующие клетки U2OS окрашивали DAPI и количественно определяли процент ядер, демонстрирующих микроядра (стрелка). Среднее ± SEM ( n = 3), * P = 0.0102, непарный t-критерий Стьюдента. Масштабные линейки 10 мкм. ( I ) Модель, изображающая ось передачи сигналов ATR-N-end rule-p97, которая регулирует деградацию SDE2 Ct после повреждения UVC.

    Рисунок 6.

    UVC-индуцированная деградация SDE2 Ct способствует обходу повреждений ДНК в остановившихся репликационных вилках. ( A ) Флиппированные клетки SDE2 WT или K78V инкубировали с 10 мкМ BrdU в течение 48 ч, и наличие оцДНК анализировали с помощью иммуноокрашивания против BrdU в неденатурирующих условиях.Показаны репрезентативные изображения. Масштабная линейка 10 мкм. ( B ) Количественная оценка интенсивности BrdU с использованием Фиджи. Показаны репрезентативные результаты трех независимых экспериментов. * P <0,0001, непарный тест Стьюдента t -тест. ( C ) Перевернутые клетки SDE2 WT или K78V облучали 40 Дж / м 2 UVC и собирали через 4 часа, затем фракционировали и анализировали с помощью WB. * убиквитинированный RAD18 в S. ( D ) Перевернутые клетки WT или K78V были обратно трансфицированы GFP-Pol η на покровных стеклах, предварительно обработаны 10 мкМ EdU в течение 30 минут для маркировки клеток в S-фазе, облученные 40 Дж / м 2 UVC, и через 2 ч фокусы GFP-Pol η визуализировали с помощью иммунофлуоресценции против GFP.Показаны репрезентативные изображения GFP-Pol η из клеток EdU + (Alexa Fluor 647; фиолетовый). Масштабные линейки 10 мкм. ( E ) Количественная оценка фокусов GFP-Pol η из клеток EdU +, EdU– или всего (как EdU +, так и EdU-). Foci + указывает на> 20 определенных очагов GFP-Pol η. Среднее ± стандартное отклонение ( n = 3),> 100 клеток на условие. * P <0,01 по сравнению с WT, непарный тест Стьюдента t . ( F ) Классифицированные экспериментальные условия для расчесывания ДНК и репрезентативные изображения дорожек волокон ДНК. (G) Количественная оценка текущих развилок, гусениц только с меткой IdU (запуск нового источника) и только с меткой CldU (остановка вилки). Среднее ± стандартное отклонение ( n = 3),> 100 треков на условие. * P = 0,0154 ** P = 0,0210, непарный тест Стьюдента t -тест. ( H ) SDE2-Flag siR WT или K78V-экспрессирующие клетки U2OS окрашивали DAPI и количественно определяли процент ядер, демонстрирующих микроядра (стрелка). Среднее ± SEM ( n = 3), * P = 0.0102, непарный t-критерий Стьюдента. Масштабные линейки 10 мкм. ( I ) Модель, изображающая ось передачи сигналов ATR-N-end rule-p97, которая регулирует деградацию SDE2 Ct после повреждения UVC.

    Одним из последствий дефектного TLS из-за нарушения оборота SDE2 будет неспособность клетки восстанавливаться после остановки репликационных вилок при повреждении UVC. Анализ динамики репликационной вилки с использованием анализа расчесывания ДНК показал, что клетки, экспрессирующие мутант K78V, имеют значительное увеличение частоты остановки вилки после УФ-облучения (рис. 6F и G).Клетки, экспрессирующие мутант K78V, демонстрировали повышенное количество более коротких треков репликации по сравнению с WT, хотя общее распределение длин треков было сходным, что указывает на более медленное восстановление вилки (дополнительная фигура S6I и J). Впоследствии клетки, экспрессирующие мутант K78V, демонстрировали повышенные уровни микроядер, что представляет повышенное расслоение хромосом, вероятно, вызванное недостаточной репликацией ДНК и хромосомными аберрациями (рис. 6H). Взятые вместе, эти результаты подтверждают идею о том, что своевременная деградация SDE2 Ct в ответ на стресс репликации, вызванный UVC, способствует передаче сигналов для обхода PCNA-зависимых повреждений ДНК, тем самым обеспечивая непрерывное развитие вилки в повреждениях ДНК и стабильность хромосом.

    ОБСУЖДЕНИЕ

    Протеолитическая ось ATR-N-end rule-p97 модулирует репликационный стресс посредством деградации SDE2

    В этом исследовании мы пролили свет на новую протеолитическую ось ATR-N-end rule-p97, которая управляет деградацией SDE2 Ct в репликационных вилках для противодействия стрессу репликации и сохранения целостности вилки. Регулируемая деградация SDE2 Ct на остановившихся вилках необходима для создания оптимальной платформы оцДНК-RPA, необходимой для обхода PCNA-зависимых повреждений ДНК и восстановления остановившихся вилок (рис. 6I).Эндолитическое расщепление SDE2 подвергает N-дегрон, распознаваемый лигазами UBR1 / 2 E3, полиубиквитинату SDE2 Ct , который, в свою очередь, подвергается экстракции хроматина и деградации, опосредованной сегрегазным комплексом p97 UFD1-NPL4 . Это происходит исключительно в контексте взаимодействия ДНК, подчеркивая способность клетки специфически распознавать и устранять пулы белков, непосредственно влияющие на репликацию и репарацию ДНК. p97 играет регулирующую роль в этом процессе, и p97-зависимое распознавание полиубиквитинированных субстратов и экстракция из хроматина могут быть ключевым этапом, ограничивающим скорость деградации Ct SDE2 , опосредованной правилом N-конца.Важно отметить, что опосредованная правилом N-конца деградация Ct SDE2 связана с сигнализацией контрольной точки ATR, чтобы облегчить деградацию Ct SDE2 в ответ на стресс репликации, путем усиления взаимодействия SDE2 Ct с p97 UFD1-NPL4 . В этом отношении наше исследование обеспечивает важное механистическое понимание того, как протеолиз регулируется с помощью зависимой от фосфорилирования передачи сигналов убиквитина в контексте DDR.

    Растущие данные подтверждают идею о том, что CAD, управляемый p97, представляет собой важный регуляторный механизм для успешных процессов репликации и репарации ДНК.Его многогранная роль была выявлена ​​путем идентификации широкого спектра субстратов в нескольких путях поддержания генома, включая инициацию репликации ДНК и прогрессию S-фазы (лицензирующий фактор CDT1 и гистон-метилтрансфераза SET8), сегрегация хромосом (Aurora B), TLS (полимераза η), межцепочечная репарация поперечных связей ДНК (FANCD2), прекращение репликации ДНК (MCM7 в геликазе CMG), эксцизионная репарация нуклеотидов (XPC и DDB2) и репарация двухцепочечных разрывов (Ku70 / 80) (22,28–34 ).Интересно, что активность p97 нацелена на конкретные ситуации с помощью различных кофакторов, включая UFD1-NPL4, SPRTN, UBXN7 и FAF1, что подчеркивает универсальность CAD и его многочисленные уровни регуляции (35,36). Недавнее исследование также выявило RTF2 в реплисоме, который должен быть удален протеасомными шаттлами DDI1 / 2 для подавления чрезмерного накопления оцДНК и коллапса вилки, тем самым предотвращая стресс репликации (37). Хотя эти примеры несколько противоречат здравому смыслу, эти примеры подчеркивают идею о том, что правильное устранение ключевых факторов надзора за геномом необходимо для тонкой настройки их активности, чтобы способствовать как передаче сигналов контрольной точки повреждения ДНК, так и восстановлению после необходимого ремонта.В случае SDE2 Ct , его постоянная ассоциация с ДНК через его домен SAP, по-видимому, пагубна для клеток, указывая на то, что своевременное удаление SDE2 Ct из застрявших вилок может быть необходимо для того, чтобы проложить путь к оптимальной передаче сигналов контрольной точки, опосредованной. за счет образования оцДНК, покрытой RPA, на соответствующих уровнях и положениях в структуре репликационной вилки и / или активного ремоделирования компонентов реплисомы для регулирования их активности на остановившихся вилках. Идентификация взаимодействующего белка SDE2 в ответвлениях репликации была бы необходима для лучшего понимания роли регулируемой деградации Ct SDE2 , тем самым предотвращая стресс репликации.

    Специфические механизмы действия SDE2 для стимулирования реакции репликационного стресса

    В настоящее время точные механизмы, с помощью которых SDE2 специфически реагирует на UVC-индуцированные повреждения ДНК, не ясны. Стресс репликации, вызванный различными генотоксическими атаками, может инициировать различные подпутиподходы контрольных точек для наиболее эффективного противодействия конкретному ущербу. Действительно, недавнее исследование продемонстрировало, что гидроксимочевина и афидиколин, которые останавливают репликацию и индуцируют накопление оцДНК, передают различные сигнальные пути для ремоделирования реплисомы в репликационных вилках (38).Кроме того, взаимодействующая с PCNA лигаза E3 TRAIP также специфически необходима для образования оцДНК и перезапуска репликационной вилки против UVC-индуцированных повреждений (39). Насколько нам известно, что до сих пор кажется уникальным для повреждений, вызванных UVC, когда они встречаются во время репликации ДНК, так это то, что они в значительной степени подвержены TLS. Поскольку известно, что TLS регулируется вышестоящими процессами PCNA-моноубиквитинирования и переключения ДНК-полимеразы, происходящими из оцДНК, покрытой RPA, мы предполагаем, что резкие, но динамические изменения разобщения между геликазой и полимеразой могут быть однозначно вызваны SDE2 Ct. для облегчения последующего переключения полимеразы TLS.Мы предполагаем, что структура самой ДНК, искаженная ультрафиолетовым излучением в непосредственной близости от застопорившейся репликативной ДНК-полимеразы, также может способствовать распространению специфической передачи сигналов. SDE2 был ранее идентифицирован iPOND на вилках активной репликации (40). SDE2 может быть частью комплекса реплисомы, регулируемый оборот которого может определять диссоциацию и деградацию других факторов в остановившихся вилках, что аналогичным образом было предложено при удалении RTF2 из реплисомы при стрессе репликации для достижения оптимальной передачи сигналов контрольной точки (37). .Примечательно, что USP1, деубиквитинирующий фермент для PCNA-Ub, деградирует исключительно в результате зависящего от повреждений UVC автодробления, способствуя моноубиквитинизации PCNA и TLS, что свидетельствует о наличии специфической передачи сигналов DDR, которая используется для ускорения восстановления остановленной вилки из повреждений ДНК, индуцированных UVC ( 41). Что еще более важно, расщепленный Ct USP1 является еще одним известным субстратом правила Arg / N-конца (21), что указывает на то, что правило N-конца модулирует репарацию UVC-повреждений по крайней мере двумя способами – путем удаления SDE2 для создания оптимальной оцДНК. Платформа -RPA для рекрутирования RAD18 и деградации USP1 для ингибирования его активности DUB, оба из которых способствуют моноубиквитинированию PCNA.

    SDE2: новый субстрат правила Arg / N-конца млекопитающих для DDR

    В соответствии с нашим исследованием, Mishra и его коллеги недавно сообщили, что расщепленный C-концевой продукт Sde2 в Schizosaccharomyces pombe модулирует сплайсинг пре-мРНК как регуляторный компонент сплайсосомы и разрушается с помощью правила Arg / N-конца. (42). Примечательно наблюдать за высококонсервативным механизмом протеолиза, который регулирует два биологически различных процесса у удаленно родственных организмов.Этот отчет вместе с нашим текущим исследованием подчеркивает роль регулируемого протеолиза правилом Arg / N-конца в метаболизме нуклеиновых кислот и поддержании генома. Интересно, однако, что Sde2 в S. pombe лишен как ДНК-связывающего домена, так и мотивов S / TQ, которые, как мы показали, тонко регулируют обмен и функцию SDE2 в клетках млекопитающих, что указывает на то, что SDE2 у высших эукариот, возможно, эволюционировал для приобретения дополнительные функции в передаче сигналов о повреждении ДНК и репарации. Поскольку правильный сплайсинг мРНК важен для противодействия аберрантному накоплению ДНК: гибриды РНК, R-петли, которые считаются основным источником репликационного стресса, SDE2 может играть более широкую роль в надзоре за геномом, охватывая такие процессы, как репликация ДНК и транскрипция. а также поддержание теломер (43).

    Существование правила N-конца, которое предполагает, что DUB может опосредовать расщепление Nt-убиквитиновой части субстрата, предполагалось в течение 30 лет; однако это было продемонстрировано только с помощью сконструированного модельного субстрата Nt-слитого ubiquitin (44–46). С другой стороны, USP1, еще один подтвержденный субстрат правила N-конца у млекопитающих, подвергается авторасщеплению через UBL своего C-конца (21). В этом отношении наше исследование демонстрирует, что SDE2 является первым физиологическим субстратом в клетках млекопитающих, который подвергается воздействию N-дегрона посредством DUB-опосредованного расщепления «на своем N-конце», как это было первоначально предложено.

    В этом исследовании мы показываем, что, хотя массовая деградация SDE2 Ct в нестрессированных ячейках в первую очередь зависит от правила N-конца, как правило N-конца, так и CRL4 CDT2 , по-видимому, работают параллельно для продвижения CAD SDE2. Ct при репликационном стрессе. Различные пути передачи сигналов убиквитина, возможно, эволюционировали, чтобы участвовать в убиквитинировании SDE2 Ct , которое сходится на p97-зависимой экстракции белков из остановившихся вилок. Регулируется ли N-end rule или CRL4 CDT2 с помощью передачи сигналов стресса репликации или p97 UFD1-NPL4 -зависимое удаление хроматина является лимитирующей стадией деградации SDE2 Ct , в настоящее время неясно.Исследование протеомики показывает, что UBR1 фосфорилируется при повреждении UVC, поэтому его активность также может регулироваться DDR (23). Мы предполагаем, что протеолитическая ось N-end rule-p97 может регулировать оборот других неизвестных факторов, необходимых для репликации ДНК и стабильности вилки. Интересно, что реплисома связана с различными игроками, участвующими в протеолизе, включая TRAIP (E3), RNF4 (E3), USP7 (DUB) и SPRTN (металлопротеаза перекрестных связей ДНК-белок) (47-51). Было бы интересно изучить, согласуется ли правило N-конца с этими протеолитическими факторами, чтобы сохранить целостность репликационной вилки.

    Таким образом, наши исследования предоставляют новое понимание того, как правило N-конца координируется с сигнализацией репликационного стресса, чтобы осуществлять протеолитический контроль над факторами надзора за геномом в ответвлениях репликации. Поскольку раковые клетки демонстрируют высокий уровень репликационного стресса, эти знания могут быть полезны для разработки терапевтических стратегий, которые используют путь правила N-конца SDE2, чтобы усугубить повышенный репликационный стресс раковых клеток и вызвать катастрофический отказ жизнеспособности раковых клеток.

    ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

    Дополнительные данные доступны в NAR Online.

    БЛАГОДАРНОСТИ

    Мы благодарим доктора Александра Варшавского (Калифорнийский технологический институт) за его содержательное обсуждение и реагенты. Мы благодарим доктора Даниэля Дюрохера (Исследовательский институт Люненфельда-Таненбаума) за линию клеток и доктора Орландо Шерера (UNIST, Корея) за критическое прочтение рукописи.

    ФИНАНСИРОВАНИЕ

    Национальных институтов здравоохранения [CA218132]; Американское онкологическое общество [RSG-18-037-01-DMC]; Фонд «Концерн»; Кэрол М.Премия Болдуина за исследования рака груди; и стартовый фонд от Исследовательского фонда и Онкологического центра Университета Стоуни-Брук (Х.К.). Финансирование платы за открытый доступ: Американское онкологическое общество.

    Заявление о конфликте интересов . Ничего не объявлено.

    ССЫЛКИ

    1.

    Zeman

    M.K.

    ,

    Цимприх

    К.А.

    Причины и последствия репликационного стресса

    .

    Nat. Cell Biol.

    2014

    ;

    16

    :

    2

    –

    9

    .2.

    Gaillard

    H.

    ,

    Garcia-Muse

    T.

    ,

    Aguilera

    A.

    Стресс репликации и рак

    .

    Nat. Преподобный Рак

    .

    2015

    ;

    15

    :

    276

    –

    289

    . 3.

    Молдавский

    G.L.

    ,

    Pfander

    B.

    ,

    Jentsch

    S.

    PCNA, маэстро репликационной вилки

    .

    Ячейка

    .

    2007

    ;

    129

    :

    665

    –

    679

    .4.

    Saldivar

    J.C.

    ,

    Cortez

    D.

    ,

    Cimprich

    K.A.

    Эссенциальная киназа ATR: обеспечение точного дублирования сложного генома

    .

    Nat. Rev. Mol. Cell Biol.

    2017

    ;

    18

    :

    622

    –

    636

    . 5.

    Marechal

    A.

    ,

    Zou

    L.

    Одноцепочечная ДНК, покрытая RPA как платформа для посттрансляционных модификаций ответа на повреждение ДНК

    .

    Cell Res.

    2015

    ;

    25

    :

    9

    –

    23

    .6.

    Lehmann

    A.R.

    ,

    Niimi

    A.

    ,

    Ogi

    T.

    ,

    Brown

    S.

    ,

    Sabbioneda

    S.

    ,

    Wing

    J.F.

    ,

    Kannouche

    P.L.

    ,

    Зеленый

    C. M.

    Транслезионный синтез: полимеразы семейства Y и переключатель полимеразы

    .

    Ремонт ДНК

    .

    2007

    ;

    6

    :

    891

    –

    899

    .7.

    Quinet

    A.

    ,

    Lemacon

    D.

    ,

    Vindigni

    A.

    Репликационная вилка Реверс: Игроки и хранители

    .

    Мол. Ячейка

    .

    2017

    ;

    68

    :

    830

    –

    833

    .8.

    Варшавский

    А.

    Путь правила N-конца и регуляция протеолизом

    .

    Protein Sci.

    2011

    ;

    20

    :

    1298

    –

    1345

    .9.

    Шрирам

    S.M.

    ,

    Ким

    B.Y.

    ,

    Квон

    Ю.Т.

    Путь правила N-конца: новые функции и молекулярные принципы распознавания субстрата

    .

    Nat. Rev. Mol. Cell Biol.

    2011

    ;

    12

    :

    735

    –

    747

    .10.

    Рамадан

    K.

    ,

    Halder

    S.

    ,

    Wiseman

    K.

    ,

    Vaz

    B.

    Стратегическая роль убиквитин-зависимой сегрегазы p97 (VCP или Cdc48) в ДНК Реплика

    .

    Хромосома

    .

    2016

    ;

    126

    :

    17

    –

    32

    .11.

    ВАЗ

    Б.

    ,

    Гальдер

    С.

    ,

    Рамадан

    K.

    Роль p97 / VCP (Cdc48) в стабильности генома

    .

    Фронт. Genet.

    2013

    ;

    4

    :

    60

    .12.

    Jo

    U.

    ,

    Cai

    W.

    ,

    Wang

    J.

    ,

    Kwon

    Y.

    ,

    D’Andrea

    AD

    ,

    Kim

    H.

    PCNA-зависимое расщепление и деградация SDE2 регулирует ответ на стресс репликации

    .

    PLoS Genet.

    2016

    ;

    12

    :

    e1006465

    .13.

    Wang

    J.

    ,

    Jo

    U.

    ,

    Joo

    S.Y.

    ,

    Kim

    H.

    FBW7 регулирует репарацию межцепочечных поперечных связей ДНК путем модуляции деградации FAAP20

    .

    Мишень

    .

    2016

    ;

    7

    :

    35724

    –

    35740

    . 14.

    Равид

    Т.

    ,

    Хохштрассер

    М.

    Разнообразие сигналов деградации в убиквитин-протеасомной системе

    .

    Nat. Rev. Mol. Cell Biol.

    2008

    ;

    9

    :

    679

    –

    690

    .15.

    Квон

    Ю.Т.

    ,

    Xia

    Z.

    ,

    An

    J.Y.

    ,

    Тасаки

    Т.

    ,

    Давыдов

    И.В.

    ,

    Seo

    J.W.

    ,

    Sheng

    J.

    ,

    Xie

    Y.

    ,

    Варшавский

    А.

    Летальность самок и апоптоз сперматоцитов у мышей, лишенных убиквитинлигазы UBR2 пути правила N-конца

    .

    Мол. Клетка. Биол.

    2003

    ;

    23

    :

    8255

    –

    8271

    . 16.

    Квон

    Ю.Т.

    ,

    Ся

    З.

    ,

    Давыдов

    И.В.

    ,

    Lecker

    S.H.

    ,

    Варшавский

    А.

    Создание и анализ линий мышей, лишенных убиквитинлигазы UBR1 (E3alpha) пути правила N-конца

    .

    Мол. Клетка. Биол.

    2001

    ;

    21

    :

    8007

    –

    8021

    . 17.

    Tasaki

    T.

    ,

    Mulder

    L.C.

    ,

    Ивамацу

    А.

    ,

    Ли

    М.Дж.

    ,

    Давыдов

    И.В.

    ,

    Варшавский

    А.

    ,

    Мюэнг

    М.

    ,

    Квон

    Ю.Т.

    Семейство убиквитин-лигаз E3 млекопитающих, которые содержат UBR-бокс-мотив и распознают N-degrons

    .

    Мол. Клетка. Биол.

    2005

    ;

    25

    :

    7120

    –

    7136

    . 18.

    Tasaki

    T.

    ,

    Zakrzewska

    A.

    ,

    Dudgeon

    D.D.

    ,

    Jiang

    Y.

    ,

    Lazo

    J.S.

    ,

    Квон

    Ю.T.

    ,

    ,

    Субстрат распознавания доменов пути правила N-конца

    .

    J. Biol. Chem.

    2009

    ;

    284

    :

    1884

    –

    1895

    ,19.

    Чой

    W.S.

    ,

    Jeong

    до н.э.

    ,

    Joo

    Y.J.

    ,

    Lee

    M.R.

    ,

    Kim

    J.

    ,

    Eck

    M.J.

    ,

    Song

    H.K.

    Структурная основа для распознавания субстратов правила N-конца UBR-боксом убиквитиновых лигаз

    .

    Nat. Struct. Мол. Биол.

    2010

    ;

    17

    :

    1175

    –

    1181

    .20.

    Матта-Камачо

    E.

    ,

    Козлов

    г.

    ,

    Li

    F.F.

    ,

    Gehring

    K.

    Структурная основа распознавания и специфичности субстрата в пути правила N-конца

    .

    Nat. Struct. Мол. Биол.

    2010

    ;

    17

    :

    1182

    –

    1187

    .21.

    Пятков

    К.И.

    ,

    Colnaghi

    L.

    ,

    Bekes

    M.

    ,

    Varshavsky

    A.

    ,

    Huang

    TT

    Автогенерируемый фрагмент деубиквитилазы Usp1 является физиологическим субстратом N -Конец пути правила

    .

    Мол. Ячейка

    .

    2012

    ;

    48

    :

    926

    –

    933

    . 22.

    Puumalainen

    M.R.

    ,

    Lessel

    D.

    ,

    Ruthemann

    P.

    ,

    Kaczmarek

    N.

    ,

    Bachmann

    K.

    ,

    Ramadan

    K.

    ,

    Naegeli

    H.

    Датчики повреждения хроматина DDB2 и XPC из-за потери сегрегазы p97 вызывает генотоксичность

    .

    Nat. Commun.

    2014

    ;

    5

    :

    3695

    . 23.

    Мацуока

    С.

    ,

    Баллиф

    Б.A.

    ,

    Smogorzewska

    A.

    ,

    McDonald

    E.R.

    3rd,

    Hurov

    K.E.

    ,

    Luo

    J.

    ,

    Bakalarski

    C.E.

    ,

    Zhao

    Z.

    ,

    Solimini

    N.

    ,

    Lerenthal

    Y.

    et al. .

    Анализ субстратов ATM и ATR выявляет обширные белковые сети, реагирующие на повреждение ДНК

    .

    Наука

    .

    2007

    ;

    316

    :

    1160

    –

    1166

    .24.

    O’Gorman

    S.

    ,

    Fox

    D.T.

    ,

    Wahl

    G.M.

    Активация гена, опосредованная рекомбиназой, и сайт-специфическая интеграция в клетках млекопитающих

    .

    Наука

    .

    1991

    ;

    251

    :

    1351

    –

    1355

    0,25.

    Бас

    T.E.

    ,

    Luzwick

    J.W.

    ,

    Кавано

    г.

    ,

    Кэрролл

    К.

    ,

    Dungrawala

    H.

    ,

    Glick

    G.G.

    ,

    Feldkamp

    M.D.

    ,

    Putney

    R.

    ,

    Chazin

    W.J.

    ,

    Cortez

    D.

    ETAA1 воздействует на застопорившиеся вилки репликации для поддержания целостности генома

    .

    Nat. Cell Biol.

    2016

    ;

    18

    :

    1185

    –

    1195

    ,26.

    Haahr

    P.

    ,

    Hoffmann

    S.

    ,

    Tollenaere

    M.A.

    ,

    Ho

    T.

    ,

    Toledo

    L.I.

    ,

    Mann

    M.

    ,

    Bekker-Jensen

    S.

    ,

    Raschle

    M.

    ,

    Mailand

    N.

    Активация киназы ATR с помощью RPA-связывающего белка ETAA1

    .

    Nat. Cell Biol.

    2016

    ;

    18

    :

    1196

    –

    1207

    0,27.

    Фэн

    С.

    ,

    Чжао

    Y.

    ,

    Xu

    Y.

    ,

    Ning

    S.

    ,

    Huo

    W.

    ,

    Hou

    M.

    ,

    Gao

    G.

    ,

    Ji

    J.

    ,

    Guo

    R.

    ,

    Xu

    D.

    Антиген 1 Юинга, связанный с опухолью, взаимодействует с белком репликации А, способствуя перезапуску остановившихся вилок репликации

    .

    J. Biol. Chem.

    2016

    ;

    291

    :

    21956

    –

    21962

    . 28.

    Раман

    M.

    ,

    Havens

    C.G.

    ,

    Уолтер

    Дж. К.

    ,

    Харпер

    Дж. У.

    Скрининг всего генома идентифицирует p97 как важный регулятор деструкции CDT1, зависимой от повреждений ДНК

    .

    Мол. Ячейка

    .

    2011

    ;

    44

    :

    72

    –

    84

    ,29.

    Рамадан

    К.

    ,

    Bruderer

    R.

    ,

    Spiga

    F.M.

    ,

    Popp

    O.

    ,

    Baur

    T.

    ,

    Gotta

    M.

    ,

    Meyer

    HH

    Cdc48 / p97 способствует реформированию ядра путем извлечения киназы Aurora B из хроматина.

    .

    Природа

    .

    2007

    ;

    450

    :

    1258

    –

    1262

    .30.

    Дэвис

    E. J.

    ,

    Lachaud

    C.

    ,

    Appleton

    P.

    ,

    Macartney

    T.J.

    ,

    Nathke

    I.

    ,

    Rouse

    J.

    DVC1 (C1orf124) рекрутирует протеин-сегрегазу p97 в участки повреждения ДНК

    .

    Nat. Struct. Мол. Биол.

    2012

    ;

    19

    :

    1093

    –

    1100

    . 31.

    Mosbech

    A.

    ,

    Gibbs-Seymour

    I.

    ,

    Kagias

    K.

    ,

    Thorslund

    T.

    ,

    Beli

    P.

    ,

    Povlsen

    L.

    ,

    Nielsen

    S.V.

    ,

    Smedegaard

    S.

    ,

    Sedgwick

    G.

    ,

    Lukas

    C.

    et al. .

    DVC1 (C1orf124) представляет собой адаптер p97, направленный на повреждение ДНК, который способствует убиквитин-зависимым ответам на блоки репликации

    .

    Nat. Struct.Мол. Биол.

    2012

    ;

    19

    :

    1084

    –

    1092

    .32.

    Maric

    M.

    ,

    Maculins

    T.

    ,

    De Piccoli

    G.

    ,

    Labib

    K.

    Cdc48 и демонтаж привода убиквитин-лигазы геликазы CMG в конце Репликация ДНК

    .

    Наука

    .

    2014

    ;

    346

    :

    1253596

    . 33.

    Гиббс-Сеймур

    I.

    ,

    Oka

    Y.

    ,

    Rajendra

    E.

    ,

    Weinert

    B.T.

    ,

    Passmore

    L.A.

    ,

    Patel

    K.J.

    ,

    Olsen

    JV

    ,

    Choudhary

    C.

    ,

    Bekker-Jensen

    S.

    ,

    Mailand

    N. Повреждение ДНК

    .

    Мол. Ячейка

    .

    2015

    ;

    57

    :

    150

    –

    164

    . 34.

    van den Boom

    J.

    ,

    Wolf

    M.

    ,

    Weimann

    L.

    ,

    Schulze

    N.

    ,

    Li

    F.

    ,

    Kaschani

    F.

    ,

    Riemer

    A.

    ,

    Zierhut

    C.

    ,

    Kaiser

    M.

    ,

    Iliakis

    G.

    et al. .

    VCP / p97 извлекает стерически захваченные кольца Ku70 / 80 из ДНК при репарации двухцепочечных разрывов

    .

    Мол. Ячейка

    .

    2016

    ;

    64

    :

    189

    –

    198

    0,35.

    Franz

    A.

    ,

    Orth

    M.

    ,

    Pirson

    P.A.

    ,

    Sonneville

    R.

    ,

    Blow

    J.J.

    ,

    Gartner

    A.

    ,

    Stemmann

    O.

    ,

    Hoppe

    T.

    CDC-48 / p97 координирует деградацию CDT-1 с диссоциацией хроматина GINS для обеспечения точной репликации ДНК

    .

    Мол. Ячейка

    .

    2011

    ;

    44

    :

    85

    –

    96

    ,36.

    van den Boom

    J.

    ,

    Meyer

    H.

    Опосредованное VCP / p97 разворачивание как принцип гомеостаза белков и передачи сигналов

    .

    Мол. Ячейка

    .

    2018

    ;

    69

    :

    182

    –

    194

    .37.

    Kottemann

    M.C.

    ,

    Conti

    B.A.

    ,

    Lach

    F.P.

    ,

    Smogorzewska

    A.

    Удаление RTF2 из заблокированных реплисом способствует поддержанию целостности генома

    .

    Мол. Ячейка

    .

    2018

    ;

    69

    :

    24

    –

    35

    0,38.

    Somyajit

    K.

    ,

    Gupta

    R.

    ,

    Sedlackova

    H.

    ,

    Neelsen

    K.J.

    ,

    Очс

    Ф.

    ,

    Раск

    М.Б.

    ,

    Choudhary

    C.

    ,

    Lukas

    J.

    Редокс-чувствительное изменение архитектуры реплисомы обеспечивает целостность генома

    .

    Наука

    .

    2017

    ;

    358

    :

    797

    –

    802

    .39.

    Harley

    M.E.

    ,

    Murina

    O.

    ,

    Leitch

    A.

    ,

    Хиггс

    M.R.

    ,

    Bicknell

    L.S.

    ,

    Yigit

    G.

    ,

    Blackford

    A.N.

    ,

    Zlatanou

    A.

    ,

    Mackenzie

    K.J.

    ,

    Редди

    К.

    и др. .

    TRAIP способствует ответу на повреждение ДНК во время репликации генома и мутирует в изначальную карликовость

    .

    Nat. Genet.

    2016

    ;

    48

    :

    36

    –

    43

    . 40.

    Dungrawala

    H.

    ,

    Rose

    K.L.

    ,

    Bhat

    K.P.

    ,

    Mohni

    K.N.

    ,

    Glick

    G.G.

    ,

    Диван

    F.B.

    ,

    Cortez

    D.

    Контрольная точка репликации предотвращает два типа разрушения вилки без регулирования стабильности реплисомы

    .

    Мол. Ячейка

    .

    2015

    ;

    59

    :

    998

    –

    1010

    .41.

    Huang

    T.T.

    ,

    Nijman

    S.M.

    ,

    Мирчандани

    К.Д.

    ,

    Galardy

    PJ

    ,

    Cohn

    MA

    ,

    Haas

    W.

    ,

    Gygi

    SP

    ,

    Ploegh

    HL

    ,

    Bernards

    R.

    ,

    AD

    Регуляция моноубиквитинированной PCNA с помощью DUB-авторасщепления

    .

    Nat. Cell Biol.

    2006

    ;

    8

    :

    339

    –

    347

    .42.

    Thakran

    P.

    ,

    Pandit

    P.A.

    ,

    Datta

    S.

    ,

    Kolathur

    K. K.

    ,

    Pleiss

    J.A.

    ,

    Мишра

    S.K.

    Sde2 представляет собой интрон-специфичный регулятор сплайсинга пре-мРНК, активируемый убиквитин-подобным процессингом

    .

    EMBO J.

    2018

    ;

    37

    :

    89

    –

    101

    .43.

    Sugioka-Sugiyama

    R.

    ,

    Sugiyama

    T.

    Sde2: новый ядерный белок, необходимый для теломерного сайленсинга и стабильности генома у Schizosaccharomyces pombe

    .

    Biochem. Биофиз. Res. Commun.

    2011

    ;

    406

    :

    444

    –

    448

    . 44.

    Bachmair

    A.

    ,

    Варшавский

    A.

    Сигнал деградации короткоживущего белка

    .

    Ячейка

    .

    1989

    ;

    56

    :

    1019

    –

    1032

    .45.

    Варшавский

    А.

    Техника слияния убиквитина и родственные методы

    .

    Methods Enzymol.

    2005

    ;

    399

    :

    777

    –

    799

    ,46.

    Bachmair

    A.

    ,

    Finley

    D.

    ,

    Varshavsky

    A.

    Время полужизни белка in vivo зависит от его аминоконцевого остатка

    .

    Наука

    .

    1986

    ;

    234

    :

    179

    –

    186

    . 47.

    Hoffmann

    S.

    ,

    Smedegaard

    S.

    ,

    Nakamura

    K.

    ,

    Mortuza

    G.B.

    ,

    Raschle

    M.

    ,

    Ibanez de Opakua

    A.

    ,

    Oka

    Y.

    ,

    Feng

    Y.

    ,

    Blanco

    F.J.

    ,

    Mann

    M.

    et al. .

    TRAIP представляет собой PCNA-связывающую убиквитинлигазу, которая защищает стабильность генома после репликационного стресса

    .

    J. Cell Biol.

    2016

    ;

    212

    :

    63

    –

    75

    . 48.

    Lecona

    E.

    ,

    Rodriguez-Acebes

    S.

    ,

    Specks

    J.

    ,

    Lopez-Contreras

    A.J.

    ,

    Руппен

    I.

    ,

    Мурга

    М.

    ,

    Муньос

    Дж.

    ,

    Mendez

    J.

    ,

    Fernandez-Capetillo

    O.

    USP7 – деубиквитиназа SUMO, необходимая для репликации ДНК

    .

    Nat. Struct. Мол. Биол.

    2016

    ;

    23

    :

    270

    –

    277

    .49.

    Ragland

    R.L.

    ,

    Patel

    S.

    ,

    Rivard

    R.S.

    ,

    Smith

    K.

    ,

    Peters

    A.A.

    ,

    Белинский

    А.K.

    ,

    Коричневый

    E.J.

    RNF4 и PLK1 необходимы для коллапса репликационной вилки в ATR-дефицитных клетках

    .

    Genes Dev.

    2013

    ;

    27

    :

    2259

    –

    2273

    .50.

    Stingele

    J.

    ,

    Bellelli

    R.

    ,

    Alte

    F.

    ,

    Hewitt

    G.

    ,

    Sarek

    G.

    ,

    Maslen

    S.L.

    ,

    Цутакава

    С.E.

    ,

    Borg

    A.

    ,

    Kjaer

    S.

    ,

    Tainer

    J.A.

    et al. .

    Механизм и регуляция репарации перекрестных связей ДНК-белок с помощью ДНК-зависимой металлопротеиназы SPRTN

    .

    Мол. Ячейка

    .

    2016

    ;

    64

    :

    688

    –

    703

    . 51.

    ВАЗ

    Б.

    ,

    Попович

    М.

    ,

    Ньюман

    J.A.

    ,

    Филден

    Дж.

    ,

    Aitkenhead

    H.

    ,

    Halder

    S.

    ,

    Singh

    A.N.

    ,

    Vendrell

    I.

    ,

    Fischer

    R.

    ,

    Torrecilla

    I.

    et al. .

    Металлопротеаза SPRTN / DVC1 управляет репарацией перекрестных связей ДНК-белок, связанной с репликацией

    .

    Мол. Ячейка

    .

    2016

    ;

    64

    :

    704

    –

    719

    .

    © Автор (ы) 2019.Опубликовано Oxford University Press от имени Nucleic Acids Research.

    Конъюгация убиквитина и SUMO в качестве биомаркеров ответа острого миелоидного лейкоза на химиотерапию

    Abstract

    Убиквитин и убиквитин-подобный SUMO ковалентно конъюгированы с тысячами белков, чтобы модулировать их функцию и судьбу. Многие из ферментов, участвующих в их конъюгации, не регулируются при раке и участвуют в ответе раковых клеток на терапию. Мы описываем здесь идентификацию биомаркеров активности этих ферментов и их использование для прогнозирования ответа острой миелоидной лейкемии (AML) на стандартную химиотерапию (даунорубицин-DNR и цитарабин-Ara-C).Мы сравнили способность экстрактов из химиочувствительных и химиорезистентных клеток AML конъюгировать убиквитин или SUMO-1 с 9000 белков, нанесенных на белковые матрицы. Мы идентифицировали 122 белка, конъюгация которых этими посттрансляционными модификаторами отмечает устойчивость AML к DNR и / или Ara-C. Основываясь на этой сигнатуре, мы определили статистический балл, прогнозирующий реакцию пациента с ОМЛ на стандартную химиотерапию. Наконец, мы разработали миниатюрный анализ, позволяющий легко оценить уровни модификации выбранных биомаркеров, и утвердили его на экстрактах клеток пациентов.Таким образом, наша работа определяет новый тип биомаркеров на основе убиквитина, которые можно использовать для прогнозирования реакции больных раком на лечение.

    Введение

    Белки семейства убиквитинов (далее вместе называемые UbL) являются пептидными посттрансляционными модификаторами (Streich & Lima, 2014). Наиболее охарактеризованными являются убиквитин и SUMO-1 до -3. СУМО-1 на 50% идентичны СУМО-2 и -3, которые идентичны на 97%. UbL ковалентно и обратимо конъюгированы с боковой цепью лизинов из тысяч белков.Их конъюгация включает специальные ферментные каскады, включающие ферменты, активирующие E1 UbL (два для убиквитина, один для SUMO), ферменты, конъюгирующие с UbL E2 (46 для убиквитина, один для SUMO) и несколько факторов E3 (∼700 для убиквитина, ∼15 для SUMO). ) (Streich & Lima, 2014). Убиквитин может конъюгироваться с самим собой посредством образования изопептидных связей между его C-концевым глицином и некоторыми из его собственных лизинов (K6, K11, K27, K29, K33, K48 и K63) (Yau & Rape, 2016). SUMO-2 и SUMO-3 также могут образовывать цепи посредством SUMOилирования специфического расположенного на N-конце лизина (K11), который отсутствует в SUMO-1 (Tatham et al, 2001).

    Из-за разнообразия белков-мишеней UbL контролирует широкий спектр клеточных функций. Как и большинство других посттрансляционных модификаторов, они могут либо скрывать, либо создавать поверхности взаимодействия на конъюгированном белке. Последствия убиквитилирования также во многом зависят от типа цепей, K48-связанные цепи убиквитина, как известно, составляют сигнал деградации белка, распознаваемый протеасомой 26S (Chau et al, 1989; Glickman & Ciechanover, 2002; Ciechanover, 2017), тогда как другие типы цепей, особенно цепи, связанные с K63 и K11, участвуют во взаимодействиях белок-белок, передаче сигналов, воспалительной реакции, репарации ДНК и рибосомной функции (Kwon & Ciechanover, 2017; Haakonsen & Rape, 2019).SUMO конъюгирован с более чем 6000, в основном ядерными, белками. В частности, многие белки, участвующие в экспрессии генов (механизмы транскрипции, факторы транскрипции, кофакторы транскрипции и гистоны), регулируются при SUMOylation (Neyret-Kahn et al, 2013; Tempé et al, 2014; Chymkowitch et al, 2015; Rosonina). et al, 2017; Cossec et al, 2018). SUMOylation также играет ключевую роль в восстановлении повреждений ДНК посредством модификации многих белков, участвующих в этом процессе (Garvin & Morris, 2017).

    Убиквитиноподобные модификаторы играют важную роль в регуляции многочисленных клеточных путей и участвуют в большинстве, если не во всех, биологических процессах.Нарушение регуляции различных ферментов, участвующих в конъюгации UbL, было обнаружено при различных формах рака с последствиями как для туморогенеза, так и для ответа на терапию (Mansour, 2018). Среди прочего, эти ферменты включают убиквитинлигазы E3, такие как MDM2 (Carr & Jones, 2016), ингибитор апоптоза (IAP) (Mohamed et al, 2017) или F-бокс, содержащий белок Skp2-cullin-F (SCF). комплексы (Уддин и др., 2016). О сверхэкспрессии / подавлении ферментов SUMOylation также сообщалось при многих раковых заболеваниях (Seeler & Dejean, 2017), включая различные гематологические заболевания (Boulanger et al, 2019).Например, было показано, что SUMO E2 сверхэкспрессируется при гепатоцеллюлярных карциномах, где он участвует в устойчивости к доксорубицину (Fang et al, 2017), или при множественной миеломе, где он является маркером плохого прогноза (Driscoll et al, 2010). Кроме того, было показано, что многие компоненты пути SUMO, включая E1, E2 и несколько белков PIAS E3, высоко экспрессируются как в B-клеточных лимфомах, так и в раке поджелудочной железы, сверхэкспрессирующем c-Myc. Это приводит к более высокой общей конъюгации SUMO и, как следствие, уязвимости этих опухолей к ингибированию SUMOylation (Hoellein et al, 2014; Biederstädt et al, 2020).Наконец, мы недавно показали, что путь SUMO играет важную роль, с одной стороны, в ответе острых миелоидных лейкозов (AML) на стандартные химиотерапевтические методы (Bossis et al, 2014), а с другой стороны, в устойчивости непромиелоцитарный ОМЛ для дифференцированной терапии с использованием ретиноевой кислоты (Baik et al, 2018). Следовательно, UbL, UbL-конъюгирующие / деконъюгирующие ферменты и UbL-конъюгированные субстраты представляют собой потенциальный новый класс биомаркеров для прогнозирования ответа рака на терапию.

    AML – это очень разнородная группа раковых заболеваний, поражающих миелоидный клон. Они возникают в результате приобретения онкогенных мутаций или перестроек гемопоэтическими стволовыми клетками или гематопоэтическими клетками-предшественниками, которые вместо того, чтобы дифференцироваться в нормальные лейкоциты, пролиферируют и проникают в костный мозг. Историческая французско-американско-британская классификация ОМЛ в основном основывалась на стадии дифференцировки лейкозных клеток. Сейчас ее заменяет классификация Всемирной организации здравоохранения, основанная на количестве и характере их генетических аномалий (Döhner et al, 2017).Последняя классификация определяет группы с благоприятным, промежуточным или неблагоприятным прогнозом (Estey, 2012; Dombret & Gardin, 2016). За исключением острого промиелоцитарного подтипа (~ 10% ОМЛ), который является единственным, который можно эффективно лечить дифференцированной терапией (ретиноевая кислота и триоксид мышьяка) (Ng & Chng, 2017), пациенты с диагнозом все другие подтипы ОМЛ обычно проходят химиотерапевтическое лечение, которое существенно не изменилось за последние 40 лет (Dombret & Gardin, 2016). Эта стандартная терапия начинается с лечения для индукции ремиссии, сочетающего два генотоксика, один антрациклин (даунорубицин-DNR или идарубицин-IDA) и цитарабин (Ara-C) (схема 3 + 7), за которым следует консолидирующее лечение с использованием только Ara-C . Однако значительная часть пациентов (20–30%) не отвечает на индукционное лечение, и среди тех, кто достигает полной ремиссии, высока частота рецидивов (~ 40% 5-летней выживаемости у пациентов младше 60 лет и ~ 20% пациентов в возрасте до 60 лет). старшие [Эстей, 2012]).

    Как и в случае большинства видов рака, в настоящее время не существует быстро реализуемого инструмента прогноза при постановке диагноза, чтобы предсказать ответ AML на стандартную химиотерапию.Это пагубно по крайней мере по двум причинам: (i) излишнее воздействие на химиорезистентных пациентов серьезных побочных эффектов, вызывающих генотоксики (Minotti et al, 2004), и (ii) потеря времени перед перенаправлением рефрактерных пациентов на новые методы лечения (таргетная терапия, иммунотерапия). и т. д.) и / или их участие в клинических испытаниях инновационных терапевтических стратегий. Транскриптомные сигнатуры теперь используются для лучшей стратификации пациентов и адаптации лечения некоторых видов рака. Однако, хотя для AML определены различные транскриптомные сигнатуры, ни одна из них не является достаточно надежной для использования в клинической практике.Протеомные сигнатуры, в частности, основанные на масс-спектрометрии, становятся многообещающими альтернативами (Panis et al, 2016). Еще ближе к биологическим функциям, дисрегулируемым при раке, модифомический или PTMomic анализы, которые отслеживают активность ферментов, участвующих в посттрансляционных модификациях белков, открывают новые перспективы в прогнозе и диагностике рака (Thygesen et al, 2018).

    Изменения в модификации UbL, часто обнаруживаемые при AML, мы использовали это гематомогенное сопоставление в качестве модели, чтобы выяснить, может ли глобальный анализ конъюгации UbL определить новый класс биомаркеров реакции пациентов на химиотерапевтическое лечение. Используя крупномасштабный скрининг на основе массива белков, мы идентифицировали UbL-сигнатуру химиорезистентности AML, состоящую из 122 белков. Затем мы определили оценку на основе выбранных белков, позволяющую прогнозировать ответ на химиотерапию как клеточных линий AML, так и клеток пациентов с AML. Наконец, мы разработали миниатюрный анализ, который можно использовать в повседневной клинической практике, для быстрой количественной оценки этих новых биомаркеров и подтвердили его значение прогноза на когорте из 37 пациентов.

    Результаты

    Анализ активности UbL-конъюгирования с использованием белковых массивов

    Для идентификации потенциальных белков-биомаркеров, модифицированных UbL, мы обратились к белковым массивам (Protoarrays; Life Technologies).Они отображают> 9000 рекомбинантных белков человека, нанесенных в двух экземплярах на предметное стекло, покрытое нитроцеллюлозой. Такие массивы уже успешно использовались для идентификации субстратов определенных E3 ubiquitin ligases с использованием либо полных клеточных экстрактов (Merbl & Kirschner, 2009), либо рекомбинантных ферментов (Gupta et al, 2007; del Rincón et al, 2010). Массивы инкубировали с клеточными экстрактами либо из хемочувствительных линий клеток AML HL-60 или U937, либо из сублиний Ara-C- (ARA-R) или DNR-устойчивых (DNR-R), которые мы создали из них (рис. 1A). .Как и ожидалось, химиорезистентные сублинии показали значительно более высокие значения IC 50 для Ara-C и DNR (рис. 1B). Наше предположение заключалось в том, что любое нарушение регуляции активности ферментов E1, E2 или E3 в химиорезистентных клетках приведет к изменениям в уровнях модификации субстрата UbL по сравнению с родительскими клетками. Чтобы максимизировать эффективность реакции, экстракты были дополнены не только рекомбинантным убиквитином или рекомбинантным-SUMO-1, чтобы избежать ограничивающих скорость количеств посттрансляционных модификаторов, но также связанными с винилсульфоном UbL, чтобы блокировать деконъюгацию UbL посредством ингибирования ферментов, деконъюгирующих UbL.В каждом независимом эксперименте контрольные условия включали ProtoArray, инкубированный с экстрактами родительских клеток, обработанных алкилирующим агентом N-этилмалеимидом (NEM), который ингибирует все ферменты UbL E1 и E2. Идентификация субстратов убиквитина и SUMO-1 и количественная оценка их модификаций достигаются путем сканирования массива после инкубации сначала с антителами, направленными либо на SUMO-1, либо на эпитоп Flag-tag, присутствующий на экзогенном убиквитине, а затем с флуоресцентными вторичными антителами (рис. 1А).Было проведено три независимых эксперимента для всех клеточных линий (всего 24 массива). Сигналы были скорректированы на фон, нормализованы с помощью пакета Protein Array Analyzer (PAA) (Turewicz et al, 2016) и проанализированы с использованием статистических тестов Велча и Уилкоксона – Манна – Уитни (подробности см. В разделе «Материалы и методы»). Это привело к идентификации 988 убиквитилированных и 83 SUMOилированных белков, 72 белка одновременно убиквитилированы и SUMOилированы (рис. 1C, S1 и таблица S1).

    Рисунок 1. Измерение активности конъюгирования UbL в экстрактах клеток острого миелоидного лейкоза с использованием ProtoArrays.

    (A) Блок-схема, используемая для характеристики сигнатуры UbL. В экстракты родительских и химиорезистентных клеток HL-60 или U937 сначала добавляли рекомбинантные UbL (чтобы избежать ограничивающих скорость количеств модификаторов) и UbL-винилсульфонов (для ингибирования активности деконъюгирования UbL). Затем их инкубировали с протеином ProtoArrays. После интенсивных промывок массивы инкубировали сначала с первичным мышиным антителом против SUMO-1 и кроличьей антисывороткой против Flag, распознающей Flag-метку, присутствующую на рекомбинантном убиквитине, добавленной в реакцию, а затем с соответствующими флуоресцентными вторичными антителами. .Сигналы флуоресценции обрабатывали с помощью пакета PAA R. Статистический анализ был проведен для определения сигнатуры UbL химиорезистентности, как описано в разделе «Материалы и методы». Для каждой клеточной линии было проведено три независимых эксперимента. (B) IC 50 хемочувствительных и химиорезистентных клеточных линий острого миелоидного лейкоза. IC 50 хемочувствительных родительских клеток HL-60 и U937 (wt) и их устойчивых аналогов (см. Раздел «Материалы и методы») (ARA-R и DNR-R) анализировали через 24 часа воздействия лекарств.n = 3, Среднее ± SEM, парный тест t с *, соответствующим P <0,05. (C) Идентификация убиквитилированных и сумоилированных белков. Нормализованные данные флуоресценции Ub и SUMO-1, полученные на всех массивах, инкубированных с экстрактами, сравнивали с усредненными сигналами на контрольных массивах (экстракты, дополненные NEM для ингибирования активности конъюгации UbL), чтобы идентифицировать устойчиво конъюгированные с UbL белки. Белки, показывающие значительные различия между двумя группами при использовании статистических тестов Велча и Вилкоксона-Манна-Уитни и имеющие средние значения интенсивности флуоресценции выше 800 (произвольный порог) на ProtoArrays, были отобраны для дальнейшего анализа.Диаграмма Венна показывает количество белков, идентифицированных как модифицированные SUMO-1 и / или убиквитином.

    Рисунок S1. Идентификация убиквитилированных и сумоилированных белков.

    Нормализованные данные флуоресценции Ub и SUMO-1, полученные на всех массивах, инкубированных с экстрактами, сравнивали с усредненными сигналами на контрольных массивах (экстракты, дополненные NEM для ингибирования активности конъюгирования UbL), чтобы идентифицировать устойчиво конъюгированные с UbL белки. Указываются названия выбранных белков, в частности тех, которые, как было установлено, были дифференциально модифицированы (см. Рис. 2).

    Идентификация UbL-сигнатуры устойчивости AML к стандартной химиотерапии

    Среди белков, идентифицированных как устойчиво убиквитилированные или SUMOylated на массивах, мы затем выбрали те, которые были дифференцированно модифицированы между клеточными экстрактами из химиорезистентных и родительских клеточных линий. Первый анализ был выполнен путем сравнения объединенных данных, полученных для всех устойчивых клеточных линий, со всеми чувствительными. Это привело к идентификации 52 белков, дифференциально модифицированных убиквитином, и 27 белков, дифференциально модифицированных SUMO-1 (рис. 2A, S2, S3 и таблица S2), четыре из которых дифференциально модифицированы обоими UbL.Чтобы идентифицировать биомаркеры, которые могут указывать на конкретные подтипы AML или устойчивость к одному из двух препаратов, мы также провели второй анализ, в котором были представлены данные для каждой клеточной линии (HL-60 и U937) и каждой устойчивости (DNR и Ara-C). рассматривается отдельно. Хотя размер выборки для каждого состояния был меньше, чем в первом анализе, и, следовательно, статистическая значимость ниже, мы идентифицировали 65 белков для убиквитина и 12 для SUMO-1, которые были дифференциально модифицированы по крайней мере в одной из устойчивых клеточных линий по сравнению с со своим родительским аналогом (Рис. 2B и Таблица S3).Среди 65 убиквитилированных белков 42 не были идентифицированы в глобальном анализе. Для белков, модифицированных SUMO-1, во втором анализе было идентифицировано восемь новых субстратов. В целом, компиляция всех данных ProtoArray (глобальный и раздельный анализы) идентифицировала признак химиорезистентности AML, включающий 94 убиквитилированных и 35 SUMO -илированных белков, что составляет в общей сложности 122 индивидуальных белка (Таблица S4). Анализ онтологии показал, что они в основном участвуют в пути убиквитин-протеасома, стрессовой реакции, репарации повреждений ДНК и аутофагии, которые часто не регулируются в химиорезистентных раковых клетках (рис. 2С).

    Рис. 2. Сигнатура химиорезистентности UbL-конъюгированного белка.

    (A) Идентификация UbL-модифицированных биомаркеров химиорезистентности острых миелоидных лейкозов. Уровни модификации белков, модифицированных убиквитином (левая панель) или SUMO-1 (центральная панель), выбранными на рис. 1C, сравнивали между всеми родительскими (U937 и HL-60) и устойчивыми к лекарствам (ARA-R или DNR-R) подлиниями. . Дифференциально модифицированные белки со значительными значениями P как в тесте Wilcoxon, подписанном рангом, так и в тесте на один образец t , а также с соотношением устойчивых к лекарствам и родительских клеток выше 1.25 или ниже 0,8 показаны красным цветом для убиквитилированных белков и синим – для SUMOилированных. Диаграмма Венна показывает перекрытие между дифференциально убиквитилированными и SUMOилированными белками. (B) Идентификация UbL-конъюгированных биомаркеров, специфичных для устойчивости клеток HL-60 и U937 к Ara-C или DNR. Статистический анализ между устойчивыми к лекарствам и родительскими клетками проводился отдельно для клеточных линий U937 и HL-60 и для каждой устойчивости к лекарствам. Количество белков, показывающих значимое значение P в одном образце t теста, и соотношение между лекарственно-устойчивыми и родительскими клетками выше 1.5 или ниже 0,66. (C) Онтологический анализ сигнатуры UbL. Онтологический анализ 122 белков сигнатуры UbL был выполнен с использованием программного обеспечения Panther.

    Рисунок S2. Убиквитин-конъюгированный протеин – признак химиорезистентности.

    Уровни модификации белков, модифицированных убиквитином, выбранных на фиг. 1C, сравнивали между всеми родительскими (U937 и HL-60) и устойчивыми к лекарствам (ARA-R или DNR-R) сублиниями. Дифференциально модифицированные белки с соотношением устойчивых к лекарствам и родительских клеток выше 1.Названы 25 или ниже 0,8.

    Рисунок S3. SUMO-конъюгированный белок признак химиорезистентности.

    Уровни модификации белков, модифицированных с помощью SUMO, выбранных на фиг. 1C, сравнивали между всеми родительскими (U937 и HL-60) и устойчивыми к лекарствам (ARA-R или DNR-R) сублиниями. Названы дифференцированно модифицированные белки с соотношением устойчивых к лекарствам и родительских клеток выше 1,25 или ниже 0,8.

    Создание показателя UbL для прогнозирования реакции пациентов на химиотерапевтические препараты

    Для дальнейшей проверки сигнатуры, в частности, на образцах пациентов, мы выбрали 23 из 122 белков, которые показали как высокий уровень модификации, так и наиболее устойчивые различия сигналов между чувствительными и устойчивыми клеточными линиями в общем или раздельном анализе (Таблица S4).На первом этапе мы использовали их для создания показателя UbL с целью прогнозирования реакции пациентов на химиотерапию. С этой целью мы применили генетический алгоритм (GA) (Scrucca, 2013) для выбора групп белков, подходящих для прогнозирования устойчивости к химиотерапии в клеточных линиях и у пациентов. Мы использовали 30 переменных, соответствующих 23 выбранным белкам (7 SUMOylated + 9 ubiquitylated + 2×7 SUMOylated и ubiquitylated) (см. Раздел «Материалы и методы»). GA был запущен на наборах данных клеточных линий несколько раз с различными настройками параметров для получения в общей сложности 40 решений (комбинаций выбранных белков).Из 30 переменных 25 были выбраны хотя бы один раз из 40 полученных решений. Они были ранжированы по частоте отбора (рис. 3A), поскольку часто выбираемые белки с большей вероятностью будут предсказуемыми. Затем мы разделили этот список на пять встроенных подмножеств, содержащих увеличивающееся количество выбранных переменных / белков (рис. 3A) для линейного дискриминантного анализа (LDA), который использует оптимизированную линейную комбинацию всех переменных для назначения наблюдений целевым классам (здесь чувствительные или стойкий).Как и ожидалось, мы наблюдали, что наиболее часто выбираемые белки присутствовали в наиболее предсказуемых отобранных растворах, что предполагало, что они не были случайными артефактами из-за ГА.

    Рисунок 3. Генерация UbL-прогнозирующей оценки ответа острого миелоидного лейкоза на химиотерапию.

    (A) Выбор лучших белков для прогнозирования. Список из 30 предикторов среди 122 сигнатурных белков был выбран для запуска генетического алгоритма. Эти предикторы соответствовали 23 белкам, модифицированным убиквитином (Ub), SUMO (Su) или обоими UbL.Скорость отбора каждого из этих белков и связанного с ним UbL (Ub или Su) указана на графике. Белки были разделены на пять подмножеств для анализа линейного дискриминантного анализа. (B, C) Вероятность повышенной чувствительности / резистентности к острым миелоидным лейкозам с использованием раствора подмножества 2. (B, C) Семь белков, показывающих наивысшую скорость отбора в генетическом алгоритме (подмножество 2), были использованы для линейного дискриминантного анализа для прогнозирования вероятности устойчивости клеточных линий U937 и HL60 (B) или образцов пациентов ( C).Клетки считались чувствительными к химиотерапии, если вероятность принадлежать к группе резистентных клеток была ниже 50%, и резистентными, если более 50%.

    Чтобы проверить подход, мы сначала использовали LDA на клеточных линиях со всеми подмножествами и обнаружили, что раствор, содержащий 7 лучших белков в GA (подмножество 2), был наиболее эффективным и мог предсказать, была ли клеточная линия чувствительной или устойчивы к DNR или Ara-C в 16 случаях из 18 протестированных (шесть клеточных линий и три повтора) (рис. 3B).Чтобы определить, можно ли его также использовать для прогнозирования реакции пациентов с ОМЛ на эти препараты, мы обратились к аспиратам костного мозга четырех пациентов, все они принадлежали к довольно незрелому подтипу M1 по французско-американской британской классификации. Двое из этих пациентов были чувствительны к индукционной химиотерапии (антрациклин + цитарабин), а двое – к рефрактерной (таблица S5). Эти образцы использовали для приготовления экстрактов и зондирования ProtoArrays, как описано выше для клеточных линий. Интересно, что LDA, содержащая белки «подмножества 2», может предсказывать ответ на химиотерапию у всех четырех протестированных пациентов (рис. 3C).Хотя большее количество образцов пациентов все еще необходимо протестировать для более надежной проверки подхода, наши данные свидетельствуют о том, что идентифицированные нами биомаркеры могут использоваться для прогнозирования реакции пациентов с ОМЛ на химиотерапию.

    Разработка миниатюрного анализа для измерения модификации сигнатурного белка с помощью UbL

    Прототипы полезны для идентификации сигнатур. Однако их трудно внедрить для рутинной клинической диагностики из-за необходимого количества клеток, проблемы их стандартизации и их высокой стоимости.Чтобы обойти эти трудности, мы разработали миниатюрный анализ проточной цитометрии, чтобы дополнительно оценить значение прогноза биомаркеров, которые мы идентифицировали. Этот анализ основан на использовании шариков Luminex xMap, которые представляют собой магнитные шарики с цветовой кодировкой. Чтобы проверить это, мы клонировали 23 выбранных белка (Таблица S4) как гибридные с GST. 10 из них могли быть продуцированы в Escherichia coli и были связаны с разноцветными шариками xMap. Затем связанные шарики мультиплексировали и инкубировали с клеточными экстрактами.Затем они были проанализированы с помощью проточной цитометрии с использованием, во-первых, антител против SUMO-1 или антител к Flag для количественной оценки модификации SUMO-1 и убиквитином, соответственно, а затем с помощью специфических вторичных антител, связанных с двумя разными флуорохромами (рис. 4A). ). Если убиквитилирование было обнаружено на всех протестированных белках, это, однако, не относилось к SUMOylation. Наиболее вероятное объяснение этого несоответствия состоит в том, что убиквитин может образовывать длинные полиубиквитиновые цепи, облегчая их обнаружение на белковых субстратах, тогда как SUMO не может.Следовательно, мы сосредоточили остальную часть нашего исследования на убиквитилированных белках. Из 10 протестированных белков четыре белка (UBADC1, STAM, SQSTM1 и HIP2) показали значительные различия в уровнях убиквитилирования между родительским, Ara-C– и / или DNR-устойчивым U937 (рис. 4B и C). Интересно, что хотя все белки инкубировали одновременно в одних и тех же экстрактах, различия в их модификации можно было обнаружить. Например, наивысшее убиквитилирование STAM было получено с использованием экстрактов из Ara-C-устойчивых клеток, тогда как UBADC1 и HIP2 показали повышенную модификацию только с экстрактами устойчивых к DNR клеток.В целом, эти данные свидетельствуют о том, что обнаружение убиквитилирования на основе гранул обеспечивает простой и количественный способ обнаружения специфических изменений в каскаде убиквитилирования и идентификации STAM, UBADC1, SQSTM1 и HIP2 как потенциальных Ub-модифицируемых биомаркеров химиорезистентности AML.

    Рисунок 4. Анализ проточной цитометрии для обнаружения UbL-конъюгированных биомаркеров химиорезистентности в клеточных линиях и образцах пациентов.

    (A) Принцип анализа. Рекомбинантные сигнатурные белки продуцируются в E.coli и соединены с разноцветными шариками xMap. Затем связанные шарики смешивают и инкубируют с клеточными экстрактами, дополненными рекомбинантным UbL, в присутствии UbL-винилсульфонов для ингибирования активности деконъюгирования. Модификация белка количественно оценивается с помощью проточной цитометрии с использованием комбинации первичных антител, направленных на UbL, и флуоресцентных вторичных антител. (A, B, C) Анализ убиквитилирования STAM, SQSTM1, UBADC1 и HIP2. Экстракты из родительских клеток, клеток ARA-R или DNR-R U937 использовали, как описано в (A), с шариками, связанными с STAM, SQSTM1, UBADC1 и HIP2. (B) Типичные профили проточной цитометрии для их убиквитилирования показаны на (B). (C) Количественная оценка представлена ​​в (C). Для количественной оценки фон (клеточные экстракты, дополненные NEM для ингибирования активности конъюгации UbL) вычитали, и было показано соотношение между устойчивыми и родительскими клеточными линиями (n = 6 для STAM, n = 3 для SQSTM1, UBADC1 и HIP2). Среднее ± SEM. Парный тест t , * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0.001. (D) Экстракты аспиратов костного мозга 37 пациентов при постановке диагноза использовали в мультиплексном анализе проточной цитометрии с использованием гранул xMap, связанных с STAM, UBADC1 и SQSTM1. 29 пациентов ответили на индукционную химиотерапию (<10% бластов в костном мозге через 30 дней после начала химиотерапии) и 10 нет (> 10% бластов в костном мозге через 30 дней после начала химиотерапии). Среднее ± SEM. Непарный тест т с поправкой Велча. Для рефрактерных пациентов пациенты с высоким убиквитилированием по крайней мере для одного из биомаркеров имеют цветную маркировку.MFI – средняя интенсивность флуоресценции; нс, не имеет значения.

    Анализ сигнатурных белков UbL в первичных клетках AML с использованием миниатюрного анализа проточной цитометрии

    Для дальнейшей проверки использования анализа на основе гранул мы использовали экстракты клеток, приготовленные из аспиратов костного мозга 37 пациентов, которые ответили или не ответили на индукционная химиотерапия. Мы обнаружили, что экстракты клеток, полученные от пациентов, которые не ответили на индукционную химиотерапию, приводили к более высоким уровням убиквитилирования in vitro STAM, UBADC1 или SQSTM1 по сравнению с таковыми от пациентов, которые ответили (рис. 4D и таблица S5).6 из 10 рефрактерных пациентов показали высокие уровни убиквитилирования по крайней мере для одного из биомаркеров. В большинстве случаев не все биомаркеры имели высокие уровни убиквитилирования, что позволяет предположить, что комбинация биомаркеров имеет более высокую прогностическую ценность, чем каждый биомаркер по отдельности. В целом это предполагает, что белки-сигнатуры убиквитилирования, включая, среди них, STAM, UBADC1 и SQSTM1, могут служить биомаркером терапевтического ответа при AML.

    Обсуждение

    Таким образом, наша работа указывает на новый класс биомаркеров, основанный на конъюгации убиквитина и SUMO, которые могут быть использованы для прогнозирования ответа пациентов с AML на стандартные химиотерапевтические методы.Кроме того, мы разработали миниатюрный анализ, который позволяет количественно определять эти биомаркеры с использованием небольшого количества клеток и поддается использованию образцов пациентов.

    Нарушение регуляции протеома, конъюгированного с убиквитином и SUMO, в раковых клетках может быть связано с повышенной / пониженной экспрессией их соответствующих ферментов, конъюгированных с E1 / E2 / E3, которые можно (частично) контролировать с помощью транскриптомных подходов. Однако в большинстве случаев они связаны с изменениями в их деятельности, которые сложнее контролировать, особенно в образцах пациентов.Масс-спектрометрия широко используется для анализа на уровне протеома клеточного белка SUMOylome и ubiquitylome (Hendriks & Vertegaal, 2016; Heap et al, 2017). Однако, хотя чувствительность этой технологии быстро увеличивается, для нее по-прежнему требуется большое количество материала, что, как правило, несовместимо с использованием образцов пациентов в качестве исходного материала. Более того, биологическая лабильность изопептидной связи, связывающей UbL с их субстратами, делает их масс-спектрометрическую идентификацию особенно сложной задачей.Мы использовали здесь белковые массивы для отслеживания изменений активности UbL-конъюгированных ферментов. Технология белкового массива наделена рядом преимуществ. Во-первых, поскольку он основан на ферментативной активности, он подходит для относительно небольшого числа клеток по сравнению с методами масс-спектрометрии. Во-вторых, он не полагается на обилие пятнистых белков, потому что они присутствуют в избытке и в аналогичных количествах на массивах. Наконец, он позволяет анализировать два разных UbL в одном образце / эксперименте.Мы сосредоточили наше исследование на конъюгации убиквитина и SUMO, поскольку эти модификаторы являются наиболее охарактеризованными и наиболее изученными UbL. Мы идентифицировали 988 убиквитилированных и 83 SUMOилированных белка, которые надежно модифицированы на массивах белков с использованием клеточных экстрактов. Таким образом, эти белки можно использовать в качестве биомаркеров активности ферментов (E1, E2 и E3s), ответственных за их модификацию убиквитином и / или SUMO in vitro. Следует отметить, что этот анализ не отслеживает активность ферментов, деконъюгированных с UbL, поскольку они ингибируются UbL-винилсульфонами.Многие из идентифицированных нами конъюгированных белков сами участвуют в путях конъюгации / деконъюгации UbL. Это, вероятно, отражает их более высокую способность взаимодействовать с ферментами этого пути, в том числе посредством нековалентных взаимодействий с убиквитином или SUMO. Однако важно подчеркнуть, что идентифицированные нами белки-мишени для UbL не обязательно являются подлинными мишенями для соответствующих ферментов, конъюгирующих с UbL, in vivo. По крайней мере, одно из объяснений этого состоит в том, что многие ферменты цикла UbL, а также субстратные белки пространственно разделены в живых клетках и могут никогда (или в незначительной степени) не встречаться in vivo, ситуация, которая больше не сохраняется при обращении к клеточным экстрактам. в пробирке in vitro.

    Мы показываем здесь, что изменения путей конъюгации убиквитина и SUMO связаны с устойчивостью AML к DNR и Ara-C. Мы идентифицировали 122 белка, убиквитилирование / SUMOylation которых изменяется при использовании клеточных экстрактов из линий клеток AML, устойчивых к DNR или Ara-C, по сравнению с клеточными экстрактами из их чувствительных к химиотерапии аналогов. В большинстве случаев их убиквитилирование / сумоилирование увеличивается, что свидетельствует о сверхактивации специфических ферментов UbL в химиорезистентных клетках AML.Только небольшая часть (около 10%) убиквитин / SUMO-модифицируемых белков, идентифицированных нами на массивах, по-разному модифицирована между химиочувствительными и химиорезистентными клетками. Это говорит о том, что не все пути Ub / SUMO, а только определенные ферменты внутри этих путей нарушены в химиорезистентных клетках. Скорее всего, это ферменты E3, потому что нарушение регуляции E1 или E2 изменило бы гораздо больший репертуар субстратов. Анализ обнаруженных нами дифференциально модифицированных белков не позволил идентифицировать дисрегулируемый E3 или пути специфической лекарственной устойчивости, которые, как известно, изменяются при химиорезистентном AML.Выявление дисрегулируемых ферментов E3 может проложить путь к разработке новых терапевтических стратегий для улучшения лечения AML.

    Среди 122 сигнатурных белков UbL некоторые по-разному модифицируются только в DNR- или в Ara-C-устойчивых клетках или только в одной из двух модельных клеточных линий AML. Это говорит о том, что некоторые изменения, приводящие к изменениям активности ферментов UbL, специфичны для генотоксиков, к которым они устойчивы, и / или к подтипу AML. Затем мы сгенерировали оценки, основанные на наиболее устойчивых белках сигнатуры с точки зрения уровня и различий модификации UbL между родительскими и устойчивыми клеточными линиями AML, которые мы использовали в качестве моделей.Эти баллы использовались для данных массива белков, полученных с образцами четырех пациентов, и один из баллов мог ретроспективно предсказать ответ этих четырех пациентов на химиотерапию. Даже если количество образцов пациентов было слишком маленьким, чтобы подтвердить этот анализ на окончательной статистической основе, наша работа, тем не менее, предоставляет доказательство концепции, что такой подход может быть использован для помощи в прогнозировании реакции пациентов с ОМЛ на современные стандартные химиотерапевтические методы.

    Для дальнейшей проверки биомаркеров, которые мы идентифицировали, в частности, в образцах пациентов, было важно разработать миниатюрный анализ, который потребовал бы меньше клеток и который был бы легко и быстро (несколько часов) реализован для будущего использования в клинической практике.Анализ основан на технологии Luminex, в которой используются мультиплексируемые микрошарики с цветовой кодировкой. Эта технология обычно используется, в том числе в службах клинического анализа, для обнаружения циркулирующих гормонов, хемокинов, цитокинов или аутоантигенов с использованием гранул, соединенных с антителами, специфичными для этих белков. Здесь вместо антител мы соединили очищенные рекомбинантные белки из UbL-сигнатуры с шариками. Затем модифицированные шарики (один белок на цвет шарика) мультиплексировали и инкубировали с клеточными экстрактами, которые были приготовлены в условиях, сохраняющих активность ферментов, конъюгированных с UbL.Этот анализ может точно количественно определить уровень модификации связанного белка убиквитином и, таким образом, точно оценить различия в уровнях их модификации между образцами. Среди белков, которые мы проанализировали, мы идентифицировали четыре белка, STAM, UBADC1, SQSTM1 и HIP2, которые дифференциально убиквитилированы с экстрактами клеточных линий, устойчивых к химиотерапии, по сравнению с клетками, которые чувствительны. Однако следует отметить, что не все белки, идентифицированные на ProtoArrays, могут быть проверены с помощью анализа на основе гранул xMap.На данном этапе исследований мы не исключаем, что это могло быть связано с различиями в их конформации и / или различиями в уже существующих посттрансляционных модификациях, поскольку они были произведены в клетках насекомых в первом случае и в бактериях во втором. Наряду с этим, улучшение продукции белка и методов обнаружения может также позволить лучше обнаруживать SUMOylation белков, которые мы идентифицировали с использованием массивов белков, и улучшить прогнозную эффективность анализа. Важно отметить, что мы могли проверить прогностический потенциал убиквитилирования трех биомаркеров (STAM, UBADC1 и SQSTM1) на когорте из 37 пациентов.Их убиквитилирование было значительно выше у рефрактерных пациентов по сравнению с теми, кто ответил на химиотерапию. У 6 из 10 рефрактерных пациентов было обнаружено высокое убиквитилирование по крайней мере одного из биомаркеров. Дальнейшее развитие этого анализа потребует анализа большего количества биомаркеров сигнатуры, чтобы снизить количество ложноотрицательных результатов (4 из 10).

    ОМЛ – это неотложная медицинская помощь, так как пациенты чаще всего нуждаются в химиотерапии в ближайшие несколько дней после постановки диагноза. Однако крайне важно быстро определить соотношение риск / польза до начала текущей стандартной химиотерапии, с которой связаны тяжелые побочные эффекты.Выбор между интенсивной стандартной химиотерапией, эпигенетической терапией (например, азацитидином) и наилучшей поддерживающей терапией в настоящее время в основном зависит от возраста, физической формы и сопутствующих заболеваний пациента. Цитогенетика, в частности количество генетических аномалий, также может использоваться в качестве маркера прогноза. Однако, как правило, клиницистам требуется 1-2 недели, чтобы получить результаты. В большинстве случаев лечение необходимо начать до получения таких результатов. Мы создали основу для анализа, основанного на модификациях UbL клеточными экстрактами пациентов, которые можно проводить при постановке диагноза в течение нескольких часов вместе с анализами проточной цитометрии, обычно выполняемыми для подтверждения диагноза AML.Его результаты в сочетании с вышеупомянутыми критериями могут поэтому помочь клиницистам предложить лучший терапевтический вариант для каждого пациента, включая перенаправление на новые методы лечения или текущие клинические испытания, особенно для новых лекарств, нацеленных на убиквитин или пути SUMO.

    Материалы и методы

    Культура клеток

    Клетки HL-60 и U937 (DSMZ) культивировали при 37 ° C в среде Roswell Park Memorial Institute с добавлением 10% FBS и стрептомицина / пенициллина в присутствии 5% CO 2 .Обе клеточные линии были аутентифицированы Американской коллекцией типовых культур с использованием анализа коротких тандемных повторов. Все клетки регулярно давали отрицательный результат на микоплазму. После оттаивания клетки пассировали с плотностью 3 × 10 5 / мл каждые 2–3 дня в течение не более 10 пассажей. Клетки U937 и HL-60, устойчивые к Ara-C (цитарабину) и DNR, генерировались культивированием в присутствии возрастающих концентраций лекарственного средства (до 0,1 мкМ для Ara-C и 0,03 мкМ для DNR) в течение 2–3 мес.

    Образцы пациентов

    Аспираты костного мозга были собраны после получения письменного информированного согласия пациентов в рамках Хельсинкской декларации и после утверждения этическим комитетом учреждения «Sud Méditerranée 1» (ref 2013-A00260-45; коллекция HemoDiag) .Свежие лейкоциты очищали центрифугированием на основе плотности с использованием Histopaque 1077 (Sigma-Aldrich) и сразу использовали для приготовления экстракта. Подробные характеристики и методы лечения пациентов, участвовавших в этом исследовании, представлены в таблице S5.

    IC

    50 измерение

    Клетки высевали в концентрации 3 × 10 5 / мл в среду Roswell Park Memorial Institute, дополненную 0,1, 1, 10, 50, 100 или 250 мкМ Ara-C ( Sigma-Aldrich) или 0,01, 0.05, 0,1, 0,5, 1 или 10 мкМ даунорубицина (Sigma-Aldrich). Жизнеспособность измеряли через 24 часа с помощью теста MTS от Promega в соответствии с протоколом производителя. IC 50 рассчитывали с использованием программы GraphPad PRISM.

    Клеточные экстракты

    Клеточные линии, выращенные с плотностью 5–8 × 10 5 / мл, или аспираты костного мозга пациента центрифугировали (300 г ) при 4 ° C в течение 5 минут и один раз промывали PBS. После ресуспендирования осадка в 1 мл PBS их снова центрифугировали (16000 г ) при 4 ° C в течение 5 минут.Гранулы ресуспендировали и инкубировали при 4 ° C в течение 30 мин в гипотоническом буфере (Hepes, pH 7,5, 20 мМ, MgCl 2 1,5 мМ, KCl 5 мМ, DTT 1 мМ и 1 мг / л апротинина, лейпептина, и пепстатин) в объеме либо (i) 100 мкл на 50 × 10 6 клеток для получения концентрированных экстрактов, используемых для зондирования ProtoArray, либо (ii) 25 мкл на 2 × 10 6 клеток в случае экстрактов, используемых в Проточная цитометрия на основе гранул xMap. Лизис клеток достигался посредством четырех циклов замораживания / оттаивания с использованием жидкого азота, а ДНК разрезалась за счет 10 проходов через иглу 20-1 / 2G.Наконец, экстракты дважды центрифугировали (16000 г ) при 4 ° C в течение 20 мин, супернатанты разделяли на аликвоты, мгновенно замораживали и хранили при -80 ° C до использования.

    Белковые матрицы

    Человеческие белковые матрицы (ProtoArrays V5.0; Life Technologies), хранящиеся при -20 ° C, уравновешивали при 4 ° C в течение 15 минут, а затем насыщали блокирующим буфером ProtoArray (PA055; Life Technologies) с добавлением с синтетическим блоком (PA017; Life Technologies) и 1 мМ DTT при 4 ° C в течение 1 часа. Чтобы исследовать ProtoArrays на предмет модификации белка UbL, в экстракты клеток сначала добавляли 5 мкМ убиквитин-винилсульфон, 2.5 мкМ SUMO1-винилсульфон и 2,5 мкМ SUMO2-винилсульфон (Boston Biochem) для ингибирования соответствующих ферментов, деконъюгированных с UbL. Контрольные экстракты также инкубировали с 50 мМ NEM (Sigma-Aldrich) для ингибирования любой конъюгации UbL. Затем к экстрактам добавляли Твин-20 (0,1%), АТФ (1 мМ) и самодельные рекомбинантные SUMO-1 или SUMO-2 (15 мкМ, полученные, как описано ранее [Bossis et al, 2005]), или Флаг-убиквитин (30 мкМ; Boston Biochem) сразу же помещали на предметные стекла ProtoArray, которые затем закрывали покровным стеклом и инкубировали при 30 ° C в течение 1 ч во влажной атмосфере.Массивы промывали трижды в течение 5 минут промывочным буфером (PBS, pH 7,4, Tween 20 0,1% и 1 × синтетический блок) с добавлением 0,5% SDS, а затем дважды в течение 5 минут только промывочным буфером. Затем их инкубировали в промывочном буфере при осторожном перемешивании при 4 ° C в течение 1 ч с 1 мкг / мл кроличьего анти-Flag (F7425; Sigma-Aldrich) или мышиного анти-SUMO-1 (21C7 из Developmental Studies Hybridoma. Банк) антитела. После пяти промывок по 5 минут в промывочном буфере их инкубировали при 4 ° C в течение 90 минут с 0.5 мкг / мл меченных Alexa Fluor 647 антител против мыши или Alexa Fluor 546 антител против кроликов (Thermo Fisher Scientific). Массивы промывали пять раз в течение 5 минут промывочным буфером, один раз H 2 O и, наконец, сушили центрифугированием перед сканированием флуоресценции с использованием устройства Innoscan 710 от Innopsys.

    Анализ данных ProtoArray

    Измеренные интенсивности флуоресценции были связаны с соответствующим идентификатором белка в соответствии с их координатами на массивах с использованием программного обеспечения Mapix (Innopsys).Интенсивности обрабатывались с помощью пакета PAA R (Turewicz et al, 2016). Вкратце, (i) интенсивности дублированных белковых пятен усредняли с использованием функции LoadGPR и (ii) фон корректировали с помощью функции BackgroundCorrect. Интенсивности флуоресценции в рамках того же эксперимента были нормализованы по квантилям с использованием функции NormalizeArray. Наконец, интенсивность была нормализована между различными экспериментами с помощью функции BatchAdjust.

    Фильтрация данных

    Чтобы идентифицировать белки, модифицированные убиквитином или SUMO-1 на ProtoArrays, мы сначала должны были отфильтровать белки, показывающие значительно более высокий сигнал в разрешающих конъюгацию UbL условиях по сравнению с непермиссивными (т.е., контрольные условия с использованием экстрактов, обработанных NEM). Классический тест t не был адаптирован для использования наших результатов, так как различия в разрешающих и запрещающих конъюгацию условиях UbL могут сильно отличаться. Поэтому мы выбрали белки со значительными значениями P (ниже 0,05) как в параметрическом тесте Велча, так и в непараметрическом тесте Вилкоксона-Манна-Уитни. Затем белки, имеющие среднее нормализованное значение интенсивности флуоресценции менее 800 (произвольный порог), отфильтровывались, чтобы получить список надежно модифицированных белков.

    Идентификация дифференциально модифицированных UbL белков между химиочувствительными и химиорезистентными клетками

    Отношения интенсивности сигналов между родительскими и лекарственно-устойчивыми клетками для белков, выбранных после фильтрации данных (см. Выше), были рассчитаны с использованием обоих критериев Уилкоксона. и один образец т тест. Этот анализ сначала был проведен на всех массивах (родительских, DNR- или ARA-c-устойчивых клеточных линиях U937 и HL60). В этом случае, при большом размере выборки, мы считали дифференциально модифицированными все белки, показывающие P -значения <0.05 в обоих тестах. Для анализа отдельных клеточных линий (U937 и HL-60) и лекарств (Ara-C и DNR), при меньшем размере образца, мы рассматривали как дифференциально модифицированные белки, показывающие P -значения <0,05 в одном образце. т проба.

    Онтологический анализ

    Онтологический анализ выполнялся с использованием программного обеспечения Panther.

    GA и линейный дискриминантный анализ

    Использовался пакет R GA, обеспечивающий GA (Scrucca, 2013), и его код предоставлен в качестве дополнительных данных 1.Цель состояла в том, чтобы определить правильное количество переменных для создания экономной модели прогнозирования. GA – это математические модели, вдохновленные моделью естественного отбора Чарльза Дарвина. Естественный отбор сохраняет только наиболее приспособленных особей разных поколений. Эволюционный алгоритм улучшает выбор с течением времени и позволяет лучшему решению возникать из лучших предыдущих решений. Затем выбранные функции были протестированы с LDA с использованием пакета R MASS (Ripley, 1996; Venables & Ripley, 2002).Этот математический метод использует линейную комбинацию всех переменных для присвоения наблюдений целевым классам. С этой целью он создает правило принятия решения на основе n доступных переменных (оценка = α × R 1 + β × R 2 +…. + Ω × R n ) путем максимизации межклассовая изменчивость и минимизация внутриклассовой вариативности. Шаг перекрестной проверки, который разделяет наблюдения на две группы (обучающий набор данных, на котором основана модель, и тестовый набор данных, на котором проверяется модель), был выполнен для получения более надежных результатов.

    Производство рекомбинантных белков

    кДНК, кодирующих интересующие белки, были выделены из библиотеки Ultimate ORF (Thermo Fisher Scientific) и клонированы в векторе бактериального экспрессионного вектора pGGWA (Busso et al, 2005) с использованием технологии Gateway в соответствии с инструкциями производителя. протокол (Life Technologies). Затем конструкции трансформировали в штамм E. coli BL21 (DE3) . Продукция белка индуцировалась 1 мМ изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом (IPTG) в течение 6 часов в бактериях, экспоненциально растущих при 25 ° C.Осадки бактерий ресуспендировали в трис-HCl, pH 8,6, 50 мМ, содержащем 500 мМ NaCl и 50 мМ MgSO 4 , и быстро замораживали в жидком N 2 . После оттаивания в бактериальные суспензии добавляли лизоцим 1 мг / мл (Sigma-Aldrich), 8 мМ β-меркаптоэтанол и 1 мг / л апротинина, лейпептина и пепстатина и инкубировали при 4 ° C в течение 1 часа. Бактериальные остатки центрифугировали при 100000 г в течение 1 часа. Затем экстракт связывали с гранулами глутатион-агарозы (Generon), уравновешенными в буфере A (Tris – HCl, pH 8.6, 50 мМ, NaCl 150 мМ, MgSO 4 50 мМ, β-меркаптоэтанол 8 мМ и 1 мкг / л апротинина, лейпептина и пепстатина). Затем колонку тщательно промывали буфером А и элюировали добавлением 20 мМ восстановленного глутатиона (Sigma-Aldrich).

    Связывание белка с xMap

    2 × 10 5 магнитных гранул xMap (низкая концентрация) от Luminex переносили в микропробирку с низким связыванием (Eppendorf) и промывали, используя NaCl 500 мМ. Затем их ресуспендировали в 50 мкл MES (2-этансульфоновой кислоты), pH 6.1, 50 мМ и инкубировали в присутствии 5 мкг / мл гидрохлорида 1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимида (EDC; Pierce) и 5 ​​мкг / мл Sulfo-NHS (Pierce) при комнатной температуре в течение 20 мин под волнение. Затем шарики промывали в PBS, содержащем 500 мМ NaCl, и инкубировали с 7 мкг рекомбинантного белка для связывания в 100 мкл PBS при комнатной температуре в течение 2 часов. Затем их дважды промывали PBS, содержащим 0,1% BSA, 0,02% Tween 20, 0,05% азида натрия и 500 мМ NaCl, и хранили при 4 ° C в PBS, содержащем 0.1% БСА, 0,02% Твина-20 и 0,05% азида натрия.

    Конъюгирование

    UbL с белками, связанными с гранулами xMap

    SUMO-1-, SUMO-2- и убиквитин-винилсульфоны (0,5 мкМ каждый) добавляли к разбавленным клеточным экстрактам (10 мкл), которые инкубировали при 4 ° C. на 15 мин. Контрольные экстракты также инкубировали со 100 мМ NEM. Затем мы добавили к экстракту 10 3 связанных с белком бусинок xMap, содержащихся в 10 мкл реакционного буфера, содержащего 20 мМ Hepes, pH 7,3; 110 мМ KOAc; 2 мМ Mg (OAc) 2 ; 0.05% Твин-20; 0,5 мМ EGTA; 0,2 мг / мл овальбумина; 1 мМ DTT; 1 мг / л апротинина, лейпептина и пепстатина; 1 мМ АТФ; 30 мкМ Flag-убиквитин; 15 мкМ СУМО-1; и 15 мкМ SUMO-2. Реакции проводили при 30 ° C в течение 45 мин. Гранулы дважды промывали в течение 5 минут PBS, содержащим 0,05% Tween-20 и 0,5% SDS, и трижды в течение 5 минут PBS, содержащим 0,05% Tween-20. Затем их инкубировали с 1 мкг / мл мышиных антител против SUMO-1 (21C7) и кроличьих антител против Flag в течение 1 ч при перемешивании при комнатной температуре. После промывки в PBS, содержащем 0.05% Tween-20 в течение 5 минут, их инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре с антителами против мыши Alexa Fluor 488 и Alexa Fluor 405 в 100 мкл PBS, содержащего 0,05% Tween 20. Гранулы снова промывали в течение 5 минут PBS, содержащим 0,05% Твина 20. Затем их ресуспендировали в 200 мкл PBS и анализировали проточной цитометрией с использованием устройства LSR Fortessa от BD Biosciences. Результаты были проанализированы с помощью программного обеспечения FlowJow.

    Благодарности

    Мы благодарны Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier (IGMM) членам группы «Онкогенез и иммунотерапия» и доктору O Coux за плодотворные обсуждения и критическое прочтение рукописи.Мы благодарим платформы Montpellier Genomic Collection и Montpellier Ressources Imagerie за техническую помощь. Финансирование было предоставлено Национальным центром научных исследований (CNRS), Ligue Nationale contre le Cancer (программа Equipe Labellisée), Région Languedoc-Roussillon (контракт Chercheur d’Avenir), Association Laurette Fugain (контракт ALF-2017/02) ), Fédération Leucémie Espoir и ANR (программа «Investissements d’avenir»; ANR-16-IDEX-0006). P Gâtel получил стипендию от Университета Монпелье, Университетского госпитального центра Монпелье и Fondation Association pour la Recherche contre le Cancer (ARC).Сбор клинических данных и образцов пациентов HEMODIAG_2020 финансировался университетской больницей Монпелье, SIRIC Монпелье и регионом Лангедок-Руссильон.