Bc el1: 503 Service Temporarily Unavailable

Электронные измерительные приборы Becool, Электронный течеискатель, электронный манометрический коллектор, Электронные весы, Электронный термоанемометр, Электронный шумомер, Лампа, Инфракрасный термометр, Манометрический термометр, Компактный электронный термометр, Инфракрасный термометр, Термогигрометр, Электронный термометр, цена, стоимость, прайс, приборы, электронный штыревой термометр,

СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ

С помощью электронного манометрического коллектора (манифолда) BC-EL1 возможно произвести заправку, техническое обслуживание и пуско-наладочные работы на установках кондиционирования, холодильных системах и тепловых насосах.

Электронный манометрический коллектор (манифолд) BC-EL1 производит измерение давления всасывания, нагнетания, температуры испарения и конденсации и делает это наглядно и с высокой точностью.

Электронный манометрический коллектор (манифолд) BC-EL1 имеет два канала измерения давления (всасывание и нагнетание), диапазон измерения от –0,1 до 4,2 МПа, точность измерения 1% от диапазона, максимальное избыточное давление на стороне всасывания/нагнетания (перегрузка) 5,25 МПа.

Также электронный манометрический коллектор (манифолд) BC-EL1 имеет два канала измерения температуры к которым подключаются два температурных зонда. Зонды могут измерять как температуру воздуха, так и температуру труб, для чего имеются двое пластиковых клещей в которые вставляются сенсоры температурных зондов. Клещи позволяют измерять температуру труб с диаметрами от 6 мм (1/4") до 41 мм (1-5/8"). При необходимости возможно измерить температуру и на трубах с большим диаметром, для чего достаточно извлечь температурный сенсор из клещей и прикрепить его к трубе.

Диапазон измеряемых температур от –55º С до +125º С, точность измерения ±0.5º С. Обе температуры отображаются на LCD-дисплее одновременно.

В память прибора внесены характеристики 36 хладагентов – R12; R13; R14; R22; R23; R114; R123; R134a; R290; R401A; R401B; R402A; R402B; R404A; R406A; R407A; R407C; R408A; R409A; R410A; R414A; R416A; R417A; R420A; R421A; R422A; R422B; R422D; R424A; R427A; R434A; R437A; R502; R503; R507; R718.

Мы стремимся идти в ногу со временем и наш двухвентильный электронный манометрический коллектор (манифолд) BC-EL1 удовлетворяет самым придирчивым требованиям. Эргономичный, ударопрочный корпус. Надёжные вентили. Четыре присоединительных штуцера M1/4" SAE (один штуцер имеет золотник и колпачок). Смотровое стекло. Большой подсвечиваемый дисплей с читаемыми символами. Удобные кнопки. Интуитивное управление. Крючок для подвеса.

Инструмент и прочие расходные материалы

Компания becool производит широкий спектр качественной и надёжной продукции для ремонта и обслуживания холодильных систем, систем вентиляции и кондиционирования, в том числе и линейку электронных приборов.


Для определения фактического расхода воздуха и измерения температуры воздуха в системах вентиляции и кондиционирования воздуха используются термоанемометры. Термоанемометр BC 9201 незаменим при измерении скорости воздушного потока и температуры воздушного потока в системах вентиляции и кондиционирования.

Для более точной заправки холодильной системы хладагентом (фреоном) применяют электронные весы becool. Заправка при помощи электронных весов becool является альтернативной заправке по измерению значения перегрева (переохлаждения) производимойэлектронным манометрическим коллектором (манифолдом) BC-EL1.

Мы предлагаем электронные весы becool нескольких модификаций различающихся пределом измеряемой массы и точностью измерения: весы BC-SC-05есы BC-SC-05 (разрешение 1 гр. взвешивание до 5,0 кг.), весы BC-SC-50есы BC-SC-50 (разрешение 2 гр. взвешивание до 50 кг.), весы BC-SC-80 (разрешение 10 гр. взвешивание до 80 кг.).

Термометрыbecool представлены широкой линейкой электронных, цифровых и механических термометров предназначенных для контроля и измерения температуры воздуха на улице и внутри помещений (термометры с выносными датчиками) и различных объектов.
Термометры becool - это приборы для измерения температуры как контактным (штыревые термометры), так и бесконтактным (инфракрасный термометр, пирометр) методом. Термометры becool возможно купить у наших партнёров.

Контактные термометры:

Термометр BC-T1
Термометр BC-T2D
Термометр BC-T3
Термогигрометр BC-TW4
Термометр BC-T5

Бесконтактные термометры:

Термометр BC-105
Термометр BC-89
Термометр BC-423
Термометр BC-007

Для измерения уровня шума на рабочих местах, в жилых помещениях, в общественных зданиях, на территории жилой застройки и т.д. используются шумомеры. Электронный шумомер BC 8922 измеряет уровень шума в двух режимах. На режиме А прибор реагирует подобно человеческому уху и применяется для проведения регулирующих тестов, измерений в окружающей среде, на рабочем месте. На режиме С применяется для проведения анализа шума двигателей и механизмов.

Одним из самых точных способов заправки холодильной системы хладагентом (фреоном) является использование электронного манометрического коллектора (манифолда) BC-EL1. Измеряя значение фактического перегрева (переохлаждения) и добавляя либо стравливая из холодильной системы хладагент, можно добиться оптимальной заправки для данной холодильной системы. Этот метод является альтернативой использованию электронных весов becool. Электронный манометрический коллектор (манифолд) BC-EL1 является наиболее оптимальным по соотношению цена/качество/комплектация/срок гарантии среди представленных на рынке России аналогичных устройств.

Электронный манометрический коллектор (манифолд): BC-EL1

Обзор бас гитарной педали AMT Bass Crunch BC-1

 

Предусилитель построен по фирменной технологии компании АМТ Electronics, основанной на JFET-эмуляции лампового спектра ограничения. Широкий диапазон регулировок в сочетании с богатыми для напольного форм-фактора функциональными возможностями существенно повысили универсальность преампа.

Предусилитель AMT Bass Crunch BC-1 построен по двухканальной схеме.
CLEAN-канал формирует классический звук бас-гитары, свойственный «старым» усилителям, и позволяет получать в зависимости от положения регулятора чувствительности как бархатное прозрачное звучание, так и легкий компрессирующий перегруз.

DRIVE-канал содержит большее количество каскадов переусиления и предназначен для получения современного звука от чистого до существенно подгруженного. Включение режима High дополнительно расширяет возможности обогащения спектра в сторону увеличения плотности и агрессивности звучания. Перестраеваемый трех-позиционный средне-частотный фильтр в сочетании глубокими регулировками на краях частотного диапазона предоставляют исполнителю богатые возможности для формирования тембрального состава спектра перегруженного канала.

Ручки управления педали AMT Bass Crunch BC-1:
Канал Clean
Level – регулировка уровня выходного сигнала
High – регулировка высоких частот
Mid – регулировка средних частот
Low – регулировка низких частот
Gain – регулировка чувствительности канала
Канал Drive
Level – регулировка уровня выходного сигнала

High – регулировка высоких частот
Mid – регулировка средних частот через глубину влияния режекторного фильтра Freq. notch
Freq. notch – переключатель вырезаемых частот (режекторный фильтр) 500Hz, 330Hz, 230Hz.
Low – регулировка низких частот
Pre. Notch – переключатель режекторного фильтра перед каскадом Drive. 700Hz, 400Hz.
Gain – регулировка чувствительности канала
Общее управление
Blend – регулировка баланса уровня сигнала между каналами Clean – Drive
Master volume – регулировка общего уровня выходного сигнала BC-1.

Footswitch DRIVE – включение/выключение канала Drive.
Led – индикатор включения канала Drive
Footswitch HI/LO – включение/выключение повышенной чувствительности канала Drive.
Led – индикатор включения режима «HI/LO» с повышенной чувствительностью канала Drive.
Коммутационные разъемы.
Правая панель
INPUT – инструментальный вход предварительного усилителя
SEND FX – посыл сигнала на внешний эффект
RETURN FX – возврат сигнала с внешнего эффекта
Левая панель
OUTPUT – выход предварительного усилителя для подключения непосредственно в Power AMP.
CTRL OUT – выход управления внешними конверторами AMT TS-2MIDI

CAB.SIM. – выход предварительного усилителя для подключения в линейный вход микшерского пульта.
DI OUT – балансный выход предназначен для подключения устройств с балансным входом.
Питание
DC 18V – вход для подключения сетевого адаптера питания предварительного усилителя
Батарейный отсек – для установки и подключения двух батарей 9V.

Обзор №1

Сегодня я познакомлю вас с новинкой от наших сибирских ребят из АМТ – двухканальный преамп для бас гитары AMT Bass Crunch BC-1. Парни вышли на новый уровень качества создания гитарных педалек, когда создали гитарный ламповый преамп SS-20, счастливым обладателем которого я являюсь. Затем было ещё много гитарных преампов, и вот наконец дошла очередь радоваться и до бас гитаристов:) Давайте рассмотрим, что может Bass Crunch, для кого он создан и как его использовать.

Впечатления от педали AMT Bass Crunch BC-1

До того, как поиграть через бас кранч, мои ожидания уже сформировались – я ждал универсальную коробочку, которая выжмет качественный звук из любого комбика да ещё и с возможностью подгрузить бас. У нас на репетиционной точке стоит комбик Ashdown MAG300 4×10, он уже изрядно послужил нашему музклубу на протяжении 3х с лишним лет и его родной преамп то ли выдохся, то ли он всегда такой был, но он очень слабенько звучал. Не прокачивал. Я подключал в разрыв преамп MXR M-80 – звучало лучше, подключал свой гитарный ламповый преамп AMT SS-20 – и через него бас качал очень хорошо, лампа красит звук, что ни говори. Но преамп был гитарный, соответственно было много лишних частот. И вот я включил AMT Bass Crunch BC-1 и всё стало на места. Бас зазвучал как надо. Гибкие настройки позволяют получить самый разный звук и заставить звучать почти любой бас.

AMT Bass Crunch BC-1 представляет из себя двухканальный бас-гитарный предусилитель на полевых транзисторах, чистый канал Clean и канал пререгруза Crunch с возможностью их смешивания в пропорциях от 0 до 100%, питается он от 18 вольт (понадобятся 2 батарейки по 9 вольт). Сразу скажу, транзисторы для бас гитары – это более чем нормально, тем более транзисторы полевые и наиболее близки по звуковым характеристикам к лампам, так что бас звучит отлично! Решение с 18 вольтами, конечно, не очень популярное, но потребление тока у преампа крайне маленькое и батарейки живут долго!

Как и для чего можно использовать педаль AMT Bass Crunch BC-1?

1. Для репетиций и концертов через басовый комбик или усилитель с кабинетов. Включать его надо в разрыв, обычно это называется Return, т.е. непосредственно в усилитель мощности, который усиливает сформированный преампом звук и передаёт его на динамики. Это тот случай, когда свой звук можно получить на разной аппаратуре. В клубах и на репточках сейчас можно встретить огромное количество недорогих комбиков, у которых родной звук очень дешёвый, но если использовать внешние преампы, то эти недорогие комбики могут достойно звучать. Лично у меня именно такой случай.

2. Если нет комбаря, но есть линия (микшерный пульт или линейный вход в компьютере), то выход с эмуляцией кабинета (CAB.SIM.) решает эту проблему. Можно спокойно играть дома в компьютерные колонки (желательно побольше и помощнее. Спикерсим в педали AMT Bass Crunch BC-1 вполне нормальный, но для записи лучше использовать софтовые кабинеты.

3. Можно использовать для записи. На ниже приведённых примерах я делал так: бас гитару втыкал в бас кранч, сигнал с выхода DI Output подключал на вход звуковушки EMU USB 0202 и далее обрабатывал плагином AmpegSVX – оставлял только кабинет 8х10 – получилось недурно, учитывая, что я почти ничего не настраивал, а использовал усреднённые дефолтные настройки. Важный момент: чтобы использовать DI Output - желательно заиметь переходник со стереоджека на кэнон и подключать соответственно в сбалансированный кэнон вход на звуковушке или пульте.

Характер звука бас гитарной педали AMT Bass Crunch BC-1

Чистый канал позволяет получить классический звук, который подойдёт для большинства стилей от поп до рок и далее. При помощи эквалайзера и гейна получается самый разный звук, часть которого можно послушать на видео обзоре.

Канал Кранч даёт кранч. Он подгружает преимущественно верха и можно получить лязгающий железом бас, который используется в гранже, метале, панке и много где ещё. Я люблю такой звук – это прям то, что я искал. Добавляет яркий характер в звучание общего микса группы. Причём чистый и перегруженный канал можно смешивать в нужной пропорции.

Лично я делаю так: на перегруженном канале прибираю низы, почти совсем убираю середину (вырезаю 330гц), пре нотч фильтр ставлю на 700гц, верха оставляю на серединке и смешиваю с чистым каналом в пропорции 70% чистого на 30% перегруза (если я правильно расшифровываю положение ручки Blend на 10 часов

Обзор №2

AMT BC-1 Bass Crunch Предусилитель для бас-гитары, JFET, двухканальный

Внимание! Педаль не комплектуется блоком питания. Бесшумный блок питания DC 18В, 0.8А AC/DC можно приобрести отдельно.

Играете на бас-гитаре? Тогда советуем вам обратить внимание на этот прибор! Перед нами – гитарный предусилитель в формате педали от компании AMT Electronics. Это двухканальный преамп, основанный на технологии JFET-эмуляции лампового спектра ограничения. 

Ранее AMT создавали похожие преампы для электрогитар, но ныне и на улице бас-гитаристов праздник. Этот преамп имеет широкий диапазон регулировок и большие звуковые возможности. Созданный на основе полевых транзисторов и оттого близкий к ламповому звучанию, BC-1 удовлетворит ваши самые нескромные желания. 

Что же мы имеем внутри? Два традиционных для преампов AMT канала: Clean и Drive.
CLEAN-канал: немного поиграв на «чистом», нам будет нетрудно сформировать мнение о звучании. Это тот самый фирменный, классический звук, который мы привыкли слышать через старые ламповые усилители. Покрутим ручки (это стандартные для преампа Level, Gain, High, Mid, Low) – и на выходе получим чистый приятный бархат или легкий подгруженный звук.
DRIVE-канал: настало время перегруза? AMT BC-1 приходит на помощь и дает большой запас перегруза, с характерными каскадами и огромным разнообразием. Здесь также есть свой эквалайзер, настраивающий низы, середину и верхние высоты. Кранч здесь звучит именно как кранч, а кроме того, можно без труда получить лязгающий звук низов и хорошо подгруженные верхние частоты. Что еще? Режим High на переключателе Hi-Lo сделает канал более чувствительным, а значит перед нами открываются новые возможности для регулирования плотности и агрессивности звучания. Широчайший спектр звука вкупе с гибкими настройками – это именно то, в чем нуждается музыкант, находящийся в поисках своего собственного стиля.

Но это далеко не всё! В AMT Bass Crunch BC-1 сокрыты дополнительные возможности. Например, переключатель Freq Notch, работающий с частотами 230Гц, 330Гц и 500Гц. Или переключатель Pre Notch, который вырежет нужные частоты до их «перегрузки». Он работает как фильтр на частотах 400Гц и 700Гц. Конечно, не могло обойтись и без последовательного разрыва для петли эффектов. А еще ручка Blend, которая позволит смешивать звук чистого и перегруженного канала, если одного вам недостаточно! И да, теперь вы можете ногой, с помощью футсвитча FS-2-M, управлять подключенными миди-устройствами. 

А знаете, почему этот преамп действительно нужен вам? С ним, этим компактным и удобным в использовании устройством, вы сможете 1) ходить на репетиции и брать его на концерты, и даже дешевое оборудование в концертном зале не сможет помешать вам извлечь достойный звук; 2) записываться на звуковую карту, отправлять звук в микшерный пульт или на компьютер. С этим вам поможет спикерсим. Ваша бас-гитара хотела бы купить AMT BC-1!

Очень, очень много всего есть в этой педальке. Чтобы не запутаться, разберем по полочкам техническое устройство BC-1.

Управление:

Ручки-регуляторы (два набора для канала clean и drive):

  • Level – за этой ручкой стоит уровень выходного сигнала
  • High, Mid, Low – эквалайзер, отвечающий за высокие, средние и низкие частоты 
  • Gain – этой крутилкой определяется чувствительность канала

Отдельные ручки для канала Drive:

  • Freq. Notch – режекторный фильтр 
  • Pre Notch – фильтр, отвечающий за вырезание частот до перегруза

Остальные ручечки и свитчи:

  • Blend – ручка, смешивающая сигналы с обоих каналов в нужном соотношении 
  • Master Volume – отвечает за общий выходной сигнал преампа
  • DRIVE – футсвитч, с помощью которого мы можем перейти из одного канала в другой
  • HI/LO – футсвитч, способный понизить или повысить чувствительность перегруженного канала

Разъемы на все случаи жизни и прочее:

  • Два индикатора LED – для отображения канала и режима игры
  • INPUT – основной вход для вашего баса 
  • SEND FX – здесь вы можете отправить сигнал на внешний эффект
  • RETURN FX – здесь сигнал возвращается домой
  • OUTPUT – для подключения к усилителю 
  • CTRL OUT – разъем для MIDI-устройств
  • CAB. SIM. – кабинетный симулятор для подключения в линию
  • DI OUT – и отдельный балансный выход

Питание: DC 18V и батарейный отсек для двух батареек по 9V

Видеообзоры данной педали:

JY # 9 \ rD5Q / 18UUMm> \)) >> эндобдж 2 0 obj > поток application / pdf
  • Регламент по охране труда и технике безопасности - 296_97
  • iText® 5.2.0 © 2000-2012 1T3XT BVBA2021-06-18T11: 14: 09-07: 00 конечный поток эндобдж 5 0 obj > поток 1Y2 "_ [q4 $ 7kS> m ~ wYB # j 24t% g87 + C * - \ N + 7M ߤ z = # ɞ $] 8XzH "F) w-ȸT ه = 5_; oq [& ҉

    PX1011B-EL1 / G, 551 лист данных - Автономный PCI Express X1 PHY

    S87L51FB-7K44: Однокристальный CMOS 3.0V 8-битные микроконтроллеры

    TDA1524: Цепь управления стереозвуком / громкостью

    74HCT153PW, 112: Логика - переключатели сигналов, мультиплексоры, интегральная схема декодера (ics) трубка для поверхностного монтажа - однополярное питание; IC DUAL 4-INPUT MUX 16-TSSOP Технические характеристики: Схема: 2 x 4 1; Независимых цепей: 1; Тип установки: поверхностное крепление; Ток - выходной высокий, низкий: -; Упаковка / ящик: 16-TSSOP (0,173 дюйма, ширина 4,40 мм); упаковка: трубка; тип: мультиплексор; источник питания: однополярный; рабочая температура: -40C ~ 125C; напряжение -

    74LVC109DB, 112: Логика - триггерная интегральная схема (ics) Трубка для поверхностного монтажа, 24 мА, 24 мА 2.7 В ~ 3,6 В; IC DUAL JK F-F POS-EDGE 16SSOP Характеристики: Тип установки: Поверхностный монтаж; Упаковка / ящик: 16-SSOP (0,209 дюйма, ширина 5,30 мм); Функция: установка (предварительная установка) и сброс; Количество бит на элемент: 1; Количество элементов: 2; Ток - выходной сигнал: высокий, низкий: 24 мА, 24 мА; Тип выхода: Дифференциальный; Тип триггера: Положительный фронт; Тип: Тип JK;

    PCF8574AT / 3,518: Интерфейс - интегральная схема расширителя ввода / вывода (ics) Digi-Reel 2,5 В ~ 6 В; IC I / O EXPANDER I2C 8B 16SOIC Технические характеристики: Интерфейс: I & sup2; C; Количество входов / выходов: 8; Частота - Часы: 100 кГц; Напряжение - Питание: 2.5 В ~ 6 В; Упаковка / ящик: 16-SOIC (0,295 дюйма, ширина 7,50 мм); упаковка: цифровая катушка; рабочая температура: от -40 ° C до 85 ° C; выход прерывания: да; статус бессвинца: бессвинцовый; статус RoHS:

    BUK9612-55B, 118: Fet - Отдельный дискретный полупроводниковый прибор 75A 55V 157W поверхностный монтаж; MOSFET N-CH 55V 75A D2PAK Технические характеристики: Тип установки: поверхностный монтаж; Тип полевого транзистора: МОП-транзистор с N-каналом, оксид металла; Напряжение стока в источник (Vdss): 55 В; Ток - постоянный сток (Id) при 25 ° C: 75 А; Rds On (макс.) При Id, Vgs: 10 мОм при 25 А, 10 В; Входная емкость (Ciss) @ Vds: 3693 пФ @ 25 В; Мощность - Макс: 157 Вт; Упаковка: Cut

    OM7607 / BGA2715: комплекты для оценки и разработки RF, плата RF / if и RFID; EVAL BOARD FOR BGA2715 Технические характеристики: Тип: Усилитель; В комплекте: доска; Для использования с / сопутствующими продуктами: BGA2715; Частота: 0 Гц ~ 4 ГГц; Статус без свинца: свинец не применяется; Статус RoHS: RoHS неприменимо

    PDTC114YK, 115: Транзистор (bjt) - одиночный, дискретный полупроводниковый продукт с предварительным смещением, 100 мА, 50 В, 250 мВт, NPN - с предварительным смещением; TRANS NPN 50V 100MA SOT346 Технические характеристики: Тип транзистора: NPN - с предварительным смещением; Напряжение пробоя коллектор-эмиттер (макс.): 50 В; Ток коллектора (Ic) (макс.): 100 мА; Мощность - Макс: 250 мВт; Резистор - База (R1) (Ом): 10К; Резистор - база эмиттера (R2) (Ом): 47K; Насыщение Vce (макс.) При Ib, Ic: 100 мВ при 250 А, 5 мА; Curren

    935027530602: СЕРИЯ ABT, ОКТАЛЬНЫЙ 1-БИТНЫЙ ПЕРЕДАТЧИК, ИСТИННЫЙ ВЫХОД, PDSO20 Технические характеристики: Технология: BICMOS; Тип устройства: трансивер; Напряжение питания: 5 В; Рабочая температура: от -40 до 85 C (от -40 до 185 F); Тип упаковки: 7.50 ММ, ПЛАСТИК, МС-013, СОТ-163-1, СО-20; Контакты: 20; Особенности: RoHS

    Экспрессия EL1 и низкой молекулярной массы циклина E в груди ...

    Контекст 1

    ... и EL6 (M r 33000) генерируются расщеплением на D70. Изоформа EL4 (M r 40 000) генерируется с использованием альтернативного стартового кодона метионина 46. In vitro мы обнаружили, что введение этих LMW-форм в иммортализованные, неопухолевые эпителиальные клеточные линии молочной железы приводит к изменениям в контрольной точке G 1 -S ( 10, 11).Нарушение регуляции уровня циклина E может способствовать возникновению некоторых видов рака. Например, несколько исследований показали, что конститутивная или индуцибельная сверхэкспрессия циклина E приводит к уменьшению длины интервала G 1, ускоренному переходу в S-фазу и уменьшению размера клеток; он также снижает потребность в сыворотке крови для перехода из фазы G 1 -S (12, 13). Когда циклин E сверхэкспрессируется в фибробластах человека, этим клеткам требуется сыворотка для продолжительной пролиферации, они не образуют очагов в мягком агаре и не иммортализуются, что позволяет предположить, что избыточной экспрессии циклина E недостаточно для трансформации клеток (12).Когда циклин E сверхэкспрессируется в молочных железах трансгенных мышей через промотор ␤-лактоглобулина, у 12% животных развиваются карциномы груди, но только после длительного латентного периода в 8-13 месяцев (14), что позволяет предположить, что для этого необходимы дополнительные молекулярные события. развитие этих раковых образований. Кроме того, конститутивная сверхэкспрессия циклина E (но не циклина D1 или A) как в иммортализованных фибробластах эмбрионов крысы, так и в эпителиальных клетках молочной железы человека приводит к хромосомной нестабильности (15). Оборот циклина E, который контролируется сайт-специфическим фосфорилированием (16, 17) и F-бокс-белком Fbw7 (4), также не регулируется при раке.Fbw7, который также называют Cdc4, отвечает за деградацию циклина E человека и мутирует в клеточных линиях рака груди и яичников с высоким уровнем белка циклина E (18, 19) и по крайней мере в 16% опухолей эндометрия человека (20 ). Во всех этих исследованиях использовалась конструкция циклина E, в которой отсутствуют экзоны 1 и 2, так что трансляция начинается с метионина 16 в экзоне 3 и кодирует белок циклин E с M r 45000. Последующие исследования предоставили доказательства того, что полноразмерный циклин E, который в большом количестве встречается в опухолевых клетках, транслируется с мРНК циклина EL (т.е.е. удлиненный из 15 аминокислот вариант циклина E; Ref. 21), а не из формы M r 45000, изначально клонированной как этот циклин G 1 (22, 23). Более того, белок Mr 45000 не обнаруживается в эпителиальных клетках молочных желез, а форма циклина E, которая в большом количестве экспрессируется как в нормальных, так и в опухолевых клетках, представляет собой полноразмерный циклин EL1 с молекулярной массой Mr 50000 (5, 21 ). Остается вопрос, отличается ли биологическая роль полноразмерного циклина EL от опухолеспецифичных LMW форм.В LMW-формах циклина E отсутствуют различные количества NH 2 -конца нативной молекулы, которые образуются в результате протеолитического расщепления, опосредованного эластазой, протеазой, которая сама участвует в метастазировании рака молочной железы. Следовательно, эти низкомолекулярные формы циклина E могут быть просто суррогатным маркером плохого прогноза и не связаны напрямую с прогрессированием заболевания и метастазированием. В этом исследовании мы непосредственно рассмотрели биологическую роль низкомолекулярных форм циклина Е, используя модельную систему, сверхэкспрессирующую нативную полноразмерную или каждую из низкомолекулярных форм в эстроген-чувствительной, антиэстроген-чувствительной клеточной линии опухоли молочной железы MCF-7. .Мы показываем, что MCF-7 с избыточной экспрессией LMW-форм, а не полноразмерных форм, обладают более высокой киназной активностью, связанной с циклином E, и устойчивы к ингибированию p21 и p27 в клеточном контексте, где p53 и p21 значительно индуцируются. Эти сверхэкспрессирующие LMW клетки также устойчивы к ингибирующей рост активности антиэстрогенов, опосредованной резистентностью этих клеток к p21. Мы также показываем, что среди пациентов с ER-положительными опухолями, которые экспрессируют высокие уровни циклина E, уровень специфической выживаемости (DSS) не улучшается при лечении антиэстрогенами.Наконец, низкомолекулярные формы циклина E также вызывают хромосомные аномалии, и пациенты с высоким уровнем циклина E более склонны к полиплоидным опухолям, чем пациенты с низким уровнем циклина E. В совокупности данные, представленные в этом отчете, свидетельствуют о том, что обработка Полноразмерного циклина E в его LMW-формы может быть одним из ключевых ранних событий, ведущих к более агрессивному и летальному фенотипу рака груди. Clin E в клетках рака молочной железы. В качестве первого шага к пониманию биологических свойств низкомолекулярных форм циклина E при раке молочной железы мы создали модельную систему с использованием стабильно трансфицированных эпителиальных клеток молочной железы человека MCF-7.Родительские клетки происходят от аденокарциномы груди человека. Они являются ER-положительными, экспрессируют опухолеспецифические LMW-формы на низких уровнях (4) и являются моделью эстроген-чувствительных, антиэстроген-чувствительных опухолей молочной железы. Клетки MCF-7 трансфецировали либо одной основной цепью вектора (4.0), либо одной из трех конструкций циклина E, меченных FLAG, названных EL1, T1 или T2. Конструктивные коды EL1 для полноразмерной формы циклина E M r 50 000 (обозначены как EL1; рис. 1 A), конструктивные коды T1 для форм M r 45 000 и M r 44 000 (обозначенные как EL2 и EL3) и T2 построить коды для форм M r 35 000 и M r 33 000 (обозначенных EL5 и EL6).Следовательно, формы, генерируемые конструкциями T1 и T2, соответствуют эндогенным формам LMW, которые мы назвали EL2,3 и EL5,6 соответственно (5). EL2,3 (т.е. T1) и EL5,6 (т.е. T2) экспрессируются в ER-отрицательных клетках рака молочной железы, образованных после расщепления эластазоподобной протеазой по сайтам аминокислот 40-45 и A69-D70, соответственно ( 5). Отбирали несколько клонов, представляющих каждый из трансфицированных векторов, и их экспрессию циклина E оценивали с помощью вестерн-блоттинга с использованием антител против FLAG и против циклина E.Эти эксперименты выявили разные уровни экспрессии каждой из изоформ циклина E (рис. 1B), а уровень экспрессии циклина E в каждом клоне соответствовал его киназной активности: клоны T1 и T2 показали в 3-5 раз более высокий уровень FLAG- ассоциированная киназная активность и в 2 раза более высокая активность ассоциированной с циклином E киназы, чем у клонов EL1 (рис. 1С). Более того, сверхэкспрессия циклина E приводила к увеличению уровней экспрессии p53 (P <0,0039) и p21 (P <0,0446), тогда как p27 (P <0,3423) и Cdk2 (P <0.2584) уровни оставались относительно неизменными по сравнению с таковыми в пустых клетках, содержащих только вектор. Торможение. Затем мы исследовали биохимические взаимодействия LMW-форм циклина E с его партнером по киназе CDK2 и ингибиторами CDK2 (CKI) p21 и p27 в трех клонах, сверхэкспрессирующих циклин EL1 или одну из LMW-форм (рис. 2). Эти клоны были выбраны, так как они сверхэкспрессировали циклин E, T1 и T2 на аналогичных уровнях (т.е. в 4, 6 и 5 раз выше уровней, соответственно, чем эндогенный белок циклин E), и эта сверхэкспрессия совпадала с p53 активация и параллельная индукция p21.В клетках со сверхэкспрессией EL1 и p53, и p21 индуцировались в 2 раза по сравнению с родительским или только векторным контролем, тогда как в клонах T1 и T2 p53 и p21 индуцировались в 2,5 и 5 раз, соответственно, по сравнению с контролем. (Рис. 2 А). Несмотря на высокие уровни p21 в клетках, трансфицированных циклином E, T1- и T2-сверхэкспрессирующие клетки проявляли в 4-5 раз большую активность киназы, связанной с FLAG, чем форма EL1, и в 3 раза большую активность киназы, связанной с циклином E, и Активность киназы CDK2 по сравнению с пустыми клетками, содержащими только вектор (рис.2 Б). Следовательно, хотя уровни сверхэкспрессии циклина E между формами EL1 и LMW были сходными (рис. 2A; т.е. все в 5 раз выше, чем у эндогенного циклина E), клоны с избыточной экспрессией LMW имели более высокий уровень FLAG, циклина E и CDK2. киназной активности по сравнению с клонами EL1 (рис. 2B), даже в присутствии высоких уровней p21. Чтобы изучить механизм различий в активности киназ между формами EL1 и LMW, мы проанализировали состав иммунных комплексов циклина E в каждом из клонов (рис.2 С). Для этих экспериментов циклин E иммунопреципитировали с использованием поликлональных антител, как описано в другом месте (5, 7), с последующим вестерн-блоттингом с указанными моноклональными антителами (фиг. 2 C). Наши результаты показали, что 5-кратное увеличение уровня циклина E сопровождалось усилением связывания p21 и p27 с комплексами циклина E. В частности, комплексы EL1 содержали в 7 раз больше p21, чем контроли, тогда как комплексы T1 и T2 содержали в 15 раз больше p21, чем контроли.Точно так же степень связывания p27 с комплексами T1 и T2 была намного выше, чем с клетками EL1 или контролями (фиг. 2 C), несмотря на отсутствие увеличения базальных уровней p27 (фиг. 2 A). Это связывание p21 и p27 привело к снижению активности комплексов циклина EL1. В комплексах T1 и T2, однако, даже при высоких уровнях связывания p21 и p27, киназа циклин E была в 2 раза выше, чем активность киназы, ассоциированной с EL1, что позволяет предположить, что активности киназы циклина E, связанные с комплексами формы LMW, являются более устойчив к ингибированию p21 и p27, чем активность киназы циклина E, связанная с полноразмерным циклином E.Затем мы исследовали состав комплексов CDK2 в клонах циклина E и обнаружили, что в 4 раза больше p21 и p27 было связано с CDK2 в клонах T1 и T2, чем в клонах EL1 (рис. 2 D). Это повышенное связывание было частично связано с более высокими уровнями CDK2 в клонах T1 и T2, чем в клонах EL1 (фиг. 2 A). Мы также обнаружили большую активность киназы CDK2 в клонах T1 и T2, чем в клонах EL1, несмотря на повышенное связывание p21 и p27 с комплексами T1- и T2-Cdk2 (рис. 2, B и D). Эти результаты предполагают, что устойчивость низкомолекулярных форм циклина Е к ингибированию р21 и р27 возникает не из-за отсутствия взаимодействия между низкомолекулярными формами и этими ингибиторами.Поскольку уровни CDK2 были в 2 раза выше в клонах T1 и T2, чем в клонах EL1 (рис. 2A), более высокая киназная активность, связанная как с CDK2, так и с циклином E, в клонах T1 и T2 может отражать более высокий уровень CDK2. уровни и / или большее сродство T1 и ...

    Контекст 2

    ... не образуют очагов в мягком агаре и не иммортализуются, что позволяет предположить, что избыточной экспрессии циклина E недостаточно для трансформации клеток (12 ). Когда циклин E сверхэкспрессируется в молочных железах трансгенных мышей через промотор ␤-лактоглобулина, у 12% животных развиваются карциномы груди, но только после длительного латентного периода в 8-13 месяцев (14), что позволяет предположить, что для этого необходимы дополнительные молекулярные события. развитие этих раковых образований.Кроме того, конститутивная сверхэкспрессия циклина E (но не циклина D1 или A) как в иммортализованных фибробластах эмбрионов крысы, так и в эпителиальных клетках молочной железы человека приводит к хромосомной нестабильности (15). Оборот циклина E, который контролируется сайт-специфическим фосфорилированием (16, 17) и F-бокс-белком Fbw7 (4), также не регулируется при раке. Fbw7, который также называют Cdc4, отвечает за деградацию циклина E человека и мутирует в клеточных линиях рака груди и яичников с высоким уровнем белка циклина E (18, 19) и по крайней мере в 16% опухолей эндометрия человека (20 ).Во всех этих исследованиях использовалась конструкция циклина E, в которой отсутствуют экзоны 1 и 2, так что трансляция начинается с метионина 16 в экзоне 3 и кодирует белок циклин E с M r 45000. Последующие исследования предоставили доказательства того, что полноразмерный циклин E, который в большом количестве встречается в опухолевых клетках, транслируется с мРНК циклина EL (т. Е. Удлиненного из 15 аминокислот варианта циклина E; ссылка 21), а не с формы M r 45000. первоначально клонировали как этот циклин G 1 (22, 23). Более того, белок Mr 45000 не обнаруживается в эпителиальных клетках молочных желез, а форма циклина E, которая в большом количестве экспрессируется как в нормальных, так и в опухолевых клетках, представляет собой полноразмерный циклин EL1 с молекулярной массой Mr 50000 (5, 21 ).Остается вопрос, отличается ли биологическая роль полноразмерного циклина EL от опухолеспецифичных LMW форм. В LMW-формах циклина E отсутствуют различные количества NH 2 -конца нативной молекулы, которые образуются в результате протеолитического расщепления, опосредованного эластазой, протеазой, которая сама участвует в метастазировании рака молочной железы. Следовательно, эти низкомолекулярные формы циклина E могут быть просто суррогатным маркером плохого прогноза и не связаны напрямую с прогрессированием заболевания и метастазированием.В этом исследовании мы непосредственно рассмотрели биологическую роль низкомолекулярных форм циклина Е, используя модельную систему, сверхэкспрессирующую нативную полноразмерную или каждую из низкомолекулярных форм в эстроген-чувствительной, антиэстроген-чувствительной клеточной линии опухоли молочной железы MCF-7. . Мы показываем, что MCF-7 с избыточной экспрессией LMW-форм, а не полноразмерных форм, обладают более высокой киназной активностью, связанной с циклином E, и устойчивы к ингибированию p21 и p27 в клеточном контексте, где p53 и p21 значительно индуцируются. Эти сверхэкспрессирующие LMW клетки также устойчивы к ингибирующей рост активности антиэстрогенов, опосредованной резистентностью этих клеток к p21.Мы также показываем, что среди пациентов с ER-положительными опухолями, которые экспрессируют высокие уровни циклина E, уровень специфической выживаемости (DSS) не улучшается при лечении антиэстрогенами. Наконец, низкомолекулярные формы циклина E также вызывают хромосомные аномалии, и пациенты с высоким уровнем циклина E более склонны к полиплоидным опухолям, чем пациенты с низким уровнем циклина E. В совокупности данные, представленные в этом отчете, свидетельствуют о том, что обработка Полноразмерного циклина E в его LMW-формы может быть одним из ключевых ранних событий, ведущих к более агрессивному и летальному фенотипу рака груди.Clin E в клетках рака молочной железы. В качестве первого шага к пониманию биологических свойств низкомолекулярных форм циклина E при раке молочной железы мы создали модельную систему с использованием стабильно трансфицированных эпителиальных клеток молочной железы человека MCF-7. Родительские клетки происходят от аденокарциномы груди человека. Они являются ER-положительными, экспрессируют опухолеспецифические LMW-формы на низких уровнях (4) и являются моделью эстроген-чувствительных, антиэстроген-чувствительных опухолей молочной железы. Клетки MCF-7 трансфицировали либо основной цепью вектора (4.0) отдельно или с одной из трех конструкций циклина E, меченных FLAG, обозначенных как EL1, T1 или T2. Конструктивные коды EL1 для полноразмерной формы циклина E M r 50 000 (обозначены как EL1; рис. 1 A), конструктивные коды T1 для форм M r 45 000 и M r 44 000 (обозначенные как EL2 и EL3) и T2 построить коды для форм M r 35 000 и M r 33 000 (обозначенных EL5 и EL6). Следовательно, формы, генерируемые конструкциями T1 и T2, соответствуют эндогенным формам LMW, которые мы назвали EL2,3 и EL5,6 соответственно (5). EL2,3 (т.е., T1) и EL5,6 (т.е.T2) экспрессируются в ER-отрицательных клетках рака молочной железы, образованных после расщепления эластазоподобной протеазой по сайтам аминокислот 40-45 и A69-D70, соответственно (5). Отбирали несколько клонов, представляющих каждый из трансфицированных векторов, и их экспрессию циклина E оценивали с помощью вестерн-блоттинга с использованием антител против FLAG и против циклина E. Эти эксперименты выявили различные уровни экспрессии каждой из изоформ циклина E (рис. 1 B), а уровень экспрессии циклина E в каждом клоне соответствовал его киназной активности: клоны T1 и T2 показали в 3-5 раз более высокий уровень FLAG- ассоциированная киназная активность и в 2 раза более высокая активность киназы, ассоциированной с циклином E, чем у клонов EL1 (рис.1 В). Более того, сверхэкспрессия циклина E приводила к увеличению уровней экспрессии p53 (P <0,0039) и p21 (P <0,0446), тогда как уровни p27 (P <0,3423) и Cdk2 (P <0,2584) оставались относительно неизменными по сравнению с уровнями в пустых. только векторные ячейки. Торможение. Затем мы исследовали биохимические взаимодействия LMW-форм циклина E с его партнером по киназе CDK2 и ингибиторами CDK2 (CKI) p21 и p27 в трех клонах, сверхэкспрессирующих циклин EL1 или одну из LMW-форм (рис. 2).Эти клоны были выбраны, так как они сверхэкспрессировали циклин E, T1 и T2 на аналогичных уровнях (т.е. в 4, 6 и 5 раз выше уровней, соответственно, чем эндогенный белок циклин E), и эта сверхэкспрессия совпадала с p53 активация и параллельная индукция p21. В клетках со сверхэкспрессией EL1 и p53, и p21 индуцировались в 2 раза по сравнению с родительским или только векторным контролем, тогда как в клонах T1 и T2 p53 и p21 индуцировались в 2,5 и 5 раз, соответственно, по сравнению с контролем. (Рис. 2 А).Несмотря на высокие уровни p21 в клетках, трансфицированных циклином E, T1- и T2-сверхэкспрессирующие клетки проявляли в 4-5 раз большую активность киназы, ассоциированной с FLAG, чем форма EL1, и в 3 раза большую активность киназы, связанной с циклином E, и Активность киназы CDK2 по сравнению с пустыми клетками, содержащими только вектор (рис. 2В). Следовательно, хотя уровни сверхэкспрессии циклина E между формами EL1 и LMW были сходными (рис. 2A; т.е. все в 5 раз выше, чем у эндогенного циклина E), клоны с избыточной экспрессией LMW имели более высокие уровни FLAG, циклина E и CDK2. киназной активности по сравнению с клонами EL1 (рис.2 B), даже в присутствии высоких уровней p21. Чтобы изучить механизм различий в активности киназ между формами EL1 и LMW, мы проанализировали состав иммунных комплексов циклина E в каждом из клонов (рис. 2 C). Для этих экспериментов циклин E иммунопреципитировали с использованием поликлональных антител, как описано в другом месте (5, 7), с последующим вестерн-блоттингом с указанными моноклональными антителами (фиг. 2 C). Наши результаты показали, что 5-кратное увеличение уровня циклина E сопровождалось усилением связывания p21 и p27 с комплексами циклина E.В частности, комплексы EL1 содержали в 7 раз больше p21, чем контроли, тогда как комплексы T1 и T2 содержали в 15 раз больше p21, чем контроли. Точно так же степень связывания p27 с комплексами T1 и T2 была намного выше, чем с клетками EL1 или контролями (фиг. 2 C), несмотря на отсутствие увеличения базальных уровней p27 (фиг. 2 A). Это связывание p21 и p27 привело к снижению активности комплексов циклина EL1. В комплексах T1 и T2, однако, даже при высоких уровнях связывания p21 и p27, киназа циклин E была в 2 раза выше, чем активность киназы, ассоциированной с EL1, что позволяет предположить, что активности киназы циклина E, связанные с комплексами формы LMW, являются более устойчив к ингибированию p21 и p27, чем активность киназы циклина E, связанная с полноразмерным циклином E.Затем мы исследовали состав комплексов CDK2 в клонах циклина E и обнаружили, что в 4 раза больше p21 и p27 было связано с CDK2 в клонах T1 и T2, чем в клонах EL1 (рис. 2 D). Это повышенное связывание было частично связано с более высокими уровнями CDK2 в клонах T1 и T2, чем в клонах EL1 (фиг. 2 A). Мы также обнаружили большую активность киназы CDK2 в клонах T1 и T2, чем в клонах EL1, несмотря на повышенное связывание p21 и p27 с комплексами T1- и T2-Cdk2 (рис. 2, B и D). Эти результаты предполагают, что устойчивость низкомолекулярных форм циклина Е к ингибированию р21 и р27 возникает не из-за отсутствия взаимодействия между низкомолекулярными формами и этими ингибиторами.Поскольку уровни CDK2 были в 2 раза выше в клонах T1 и T2, чем в клонах EL1 (рис. 2A), более высокая киназная активность, связанная как с CDK2, так и с циклином E, в клонах T1 и T2 могла отражать более высокий уровень CDK2. уровни и / или большее сродство T1 и T2, чем EL1, к CDK2 (рис. 2, C и D). Следовательно, повышенная активность киназы циклин E в LMW-сверхэкспрессирующих клетках может быть частично связана с повышенным сродством T1 и T2 к Cdk2 и частично с их пониженной чувствительностью к ингибированию p21 и p27.Чтобы ответить на этот вопрос, мы исследовали киназную активность, связанную с p21 и p27, а также иммунные комплексы, связанные с каждым CKI (рис. 2, E и F). Для этого анализа CKI были иммунопреципитированы поликлональными антителами к p21 или p27, а затем подверглись как киназным анализам, так и Вестерн-блоттингу с указанными антителами (рис. 2, E – H). Результаты показывают, что активности как p21-, так и p27-связанных киназ были значительно выше в клонах T1 и T2, чем в клонах EL1.В частности, активность киназы ...

    Контекст 3

    ... промотор, у 12% животных развивается карцинома молочной железы, но только после длительного периода ожидания в 8-13 месяцев (14), что позволяет предположить, что возникают дополнительные молекулярные события необходим для развития этих видов рака. Кроме того, конститутивная сверхэкспрессия циклина E (но не циклина D1 или A) как в иммортализованных фибробластах эмбрионов крысы, так и в эпителиальных клетках молочной железы человека приводит к хромосомной нестабильности (15). Оборот циклина E, который контролируется сайт-специфическим фосфорилированием (16, 17) и F-бокс-белком Fbw7 (4), также не регулируется при раке.Fbw7, который также называют Cdc4, отвечает за деградацию циклина E человека и мутирует в клеточных линиях рака груди и яичников с высоким уровнем белка циклина E (18, 19) и по крайней мере в 16% опухолей эндометрия человека (20 ). Во всех этих исследованиях использовалась конструкция циклина E, в которой отсутствуют экзоны 1 и 2, так что трансляция начинается с метионина 16 в экзоне 3 и кодирует белок циклин E с M r 45000. Последующие исследования предоставили доказательства того, что полноразмерный циклин E, который в большом количестве встречается в опухолевых клетках, транслируется с мРНК циклина EL (т.е.е. удлиненный из 15 аминокислот вариант циклина E; Ref. 21), а не из формы M r 45000, изначально клонированной как этот циклин G 1 (22, 23). Более того, белок Mr 45000 не обнаруживается в эпителиальных клетках молочных желез, а форма циклина E, которая в большом количестве экспрессируется как в нормальных, так и в опухолевых клетках, представляет собой полноразмерный циклин EL1 с молекулярной массой Mr 50000 (5, 21 ). Остается вопрос, отличается ли биологическая роль полноразмерного циклина EL от опухолеспецифичных LMW форм.В LMW-формах циклина E отсутствуют различные количества NH 2 -конца нативной молекулы, которые образуются в результате протеолитического расщепления, опосредованного эластазой, протеазой, которая сама участвует в метастазировании рака молочной железы. Следовательно, эти низкомолекулярные формы циклина E могут быть просто суррогатным маркером плохого прогноза и не связаны напрямую с прогрессированием заболевания и метастазированием. В этом исследовании мы непосредственно рассмотрели биологическую роль низкомолекулярных форм циклина Е, используя модельную систему, сверхэкспрессирующую нативную полноразмерную или каждую из низкомолекулярных форм в эстроген-чувствительной, антиэстроген-чувствительной клеточной линии опухоли молочной железы MCF-7. .Мы показываем, что MCF-7 с избыточной экспрессией LMW-форм, а не полноразмерных форм, обладают более высокой киназной активностью, связанной с циклином E, и устойчивы к ингибированию p21 и p27 в клеточном контексте, где p53 и p21 значительно индуцируются. Эти сверхэкспрессирующие LMW клетки также устойчивы к ингибирующей рост активности антиэстрогенов, опосредованной резистентностью этих клеток к p21. Мы также показываем, что среди пациентов с ER-положительными опухолями, которые экспрессируют высокие уровни циклина E, уровень специфической выживаемости (DSS) не улучшается при лечении антиэстрогенами.Наконец, низкомолекулярные формы циклина E также вызывают хромосомные аномалии, и пациенты с высоким уровнем циклина E более склонны к полиплоидным опухолям, чем пациенты с низким уровнем циклина E. В совокупности данные, представленные в этом отчете, свидетельствуют о том, что обработка Полноразмерного циклина E в его LMW-формы может быть одним из ключевых ранних событий, ведущих к более агрессивному и летальному фенотипу рака груди. Clin E в клетках рака молочной железы. В качестве первого шага к пониманию биологических свойств низкомолекулярных форм циклина E при раке молочной железы мы создали модельную систему с использованием стабильно трансфицированных эпителиальных клеток молочной железы человека MCF-7.Родительские клетки происходят от аденокарциномы груди человека. Они являются ER-положительными, экспрессируют опухолеспецифические LMW-формы на низких уровнях (4) и являются моделью эстроген-чувствительных, антиэстроген-чувствительных опухолей молочной железы. Клетки MCF-7 трансфецировали либо одной основной цепью вектора (4.0), либо одной из трех конструкций циклина E, меченных FLAG, названных EL1, T1 или T2. Конструктивные коды EL1 для полноразмерной формы циклина E M r 50 000 (обозначены как EL1; рис. 1 A), конструктивные коды T1 для форм M r 45 000 и M r 44 000 (обозначенные как EL2 и EL3) и T2 построить коды для форм M r 35 000 и M r 33 000 (обозначенных EL5 и EL6).Следовательно, формы, генерируемые конструкциями T1 и T2, соответствуют эндогенным формам LMW, которые мы назвали EL2,3 и EL5,6 соответственно (5). EL2,3 (т.е. T1) и EL5,6 (т.е. T2) экспрессируются в ER-отрицательных клетках рака молочной железы, образованных после расщепления эластазоподобной протеазой по сайтам аминокислот 40-45 и A69-D70, соответственно ( 5). Отбирали несколько клонов, представляющих каждый из трансфицированных векторов, и их экспрессию циклина E оценивали с помощью вестерн-блоттинга с использованием антител против FLAG и против циклина E.Эти эксперименты выявили разные уровни экспрессии каждой из изоформ циклина E (рис. 1B), а уровень экспрессии циклина E в каждом клоне соответствовал его киназной активности: клоны T1 и T2 показали в 3-5 раз более высокий уровень FLAG- ассоциированная киназная активность и в 2 раза более высокая активность ассоциированной с циклином E киназы, чем у клонов EL1 (рис. 1С). Более того, сверхэкспрессия циклина E приводила к увеличению уровней экспрессии p53 (P <0,0039) и p21 (P <0,0446), тогда как p27 (P <0,3423) и Cdk2 (P <0.2584) уровни оставались относительно неизменными по сравнению с таковыми в пустых клетках, содержащих только вектор. Торможение. Затем мы исследовали биохимические взаимодействия LMW-форм циклина E с его партнером по киназе CDK2 и ингибиторами CDK2 (CKI) p21 и p27 в трех клонах, сверхэкспрессирующих циклин EL1 или одну из LMW-форм (рис. 2). Эти клоны были выбраны, так как они сверхэкспрессировали циклин E, T1 и T2 на аналогичных уровнях (т.е. в 4, 6 и 5 раз выше уровней, соответственно, чем эндогенный белок циклин E), и эта сверхэкспрессия совпадала с p53 активация и параллельная индукция p21.В клетках со сверхэкспрессией EL1 и p53, и p21 индуцировались в 2 раза по сравнению с родительским или только векторным контролем, тогда как в клонах T1 и T2 p53 и p21 индуцировались в 2,5 и 5 раз, соответственно, по сравнению с контролем. (Рис. 2 А). Несмотря на высокие уровни p21 в клетках, трансфицированных циклином E, T1- и T2-сверхэкспрессирующие клетки проявляли в 4-5 раз большую активность киназы, связанной с FLAG, чем форма EL1, и в 3 раза большую активность киназы, связанной с циклином E, и Активность киназы CDK2 по сравнению с пустыми клетками, содержащими только вектор (рис.2 Б). Следовательно, хотя уровни сверхэкспрессии циклина E между формами EL1 и LMW были сходными (рис. 2A; т.е. все в 5 раз выше, чем у эндогенного циклина E), клоны с избыточной экспрессией LMW имели более высокий уровень FLAG, циклина E и CDK2. киназной активности по сравнению с клонами EL1 (рис. 2B), даже в присутствии высоких уровней p21. Чтобы изучить механизм различий в активности киназ между формами EL1 и LMW, мы проанализировали состав иммунных комплексов циклина E в каждом из клонов (рис.2 С). Для этих экспериментов циклин E иммунопреципитировали с использованием поликлональных антител, как описано в другом месте (5, 7), с последующим вестерн-блоттингом с указанными моноклональными антителами (фиг. 2 C). Наши результаты показали, что 5-кратное увеличение уровня циклина E сопровождалось усилением связывания p21 и p27 с комплексами циклина E. В частности, комплексы EL1 содержали в 7 раз больше p21, чем контроли, тогда как комплексы T1 и T2 содержали в 15 раз больше p21, чем контроли.Точно так же степень связывания p27 с комплексами T1 и T2 была намного выше, чем с клетками EL1 или контролями (фиг. 2 C), несмотря на отсутствие увеличения базальных уровней p27 (фиг. 2 A). Это связывание p21 и p27 привело к снижению активности комплексов циклина EL1. В комплексах T1 и T2, однако, даже при высоких уровнях связывания p21 и p27, киназа циклин E была в 2 раза выше, чем активность киназы, ассоциированной с EL1, что позволяет предположить, что активности киназы циклина E, связанные с комплексами формы LMW, являются более устойчив к ингибированию p21 и p27, чем активность киназы циклина E, связанная с полноразмерным циклином E.Затем мы исследовали состав комплексов CDK2 в клонах циклина E и обнаружили, что в 4 раза больше p21 и p27 было связано с CDK2 в клонах T1 и T2, чем в клонах EL1 (рис. 2 D). Это повышенное связывание было частично связано с более высокими уровнями CDK2 в клонах T1 и T2, чем в клонах EL1 (фиг. 2 A). Мы также обнаружили большую активность киназы CDK2 в клонах T1 и T2, чем в клонах EL1, несмотря на повышенное связывание p21 и p27 с комплексами T1- и T2-Cdk2 (рис. 2, B и D). Эти результаты предполагают, что устойчивость низкомолекулярных форм циклина Е к ингибированию р21 и р27 возникает не из-за отсутствия взаимодействия между низкомолекулярными формами и этими ингибиторами.Поскольку уровни CDK2 были в 2 раза выше в клонах T1 и T2, чем в клонах EL1 (рис. 2A), более высокая киназная активность, связанная как с CDK2, так и с циклином E, в клонах T1 и T2 могла отражать более высокий уровень CDK2. уровни и / или большее сродство T1 и T2, чем EL1, к CDK2 (рис. 2, C и D). Следовательно, повышенная активность киназы циклин E в LMW-сверхэкспрессирующих клетках может быть частично связана с повышенным сродством T1 и T2 к Cdk2 и частично с их пониженной чувствительностью к ингибированию p21 и p27.