Bc el1: 503 Service Temporarily Unavailable

PX1011B-EL1 / G, 551 лист данных – Автономный PCI Express X1 PHY

S87L51FB-7K44: Однокристальный CMOS 3.0V 8-битные микроконтроллеры

TDA1524: Цепь управления стереозвуком / громкостью

74HCT153PW, 112: Логика – переключатели сигналов, мультиплексоры, интегральная схема декодера (ics) трубка для поверхностного монтажа – однополярное питание; IC DUAL 4-INPUT MUX 16-TSSOP Технические характеристики: Схема: 2 x 4 1; Независимых цепей: 1; Тип установки: поверхностное крепление; Ток – выходной высокий, низкий: -; Упаковка / ящик: 16-TSSOP (0,173 дюйма, ширина 4,40 мм); упаковка: трубка; тип: мультиплексор; источник питания: однополярный; рабочая температура: -40C ~ 125C; напряжение –

74LVC109DB, 112: Логика – триггерная интегральная схема (ics) Трубка для поверхностного монтажа, 24 мА, 24 мА 2.7 В ~ 3,6 В; IC DUAL JK F-F POS-EDGE 16SSOP Характеристики: Тип установки: Поверхностный монтаж; Упаковка / ящик: 16-SSOP (0,209 дюйма, ширина 5,30 мм); Функция: установка (предварительная установка) и сброс; Количество бит на элемент: 1; Количество элементов: 2; Ток – выходной сигнал: высокий, низкий: 24 мА, 24 мА; Тип выхода: Дифференциальный; Тип триггера: Положительный фронт; Тип: Тип JK;

PCF8574AT / 3,518: Интерфейс – интегральная схема расширителя ввода / вывода (ics) Digi-Reel 2,5 В ~ 6 В; IC I / O EXPANDER I2C 8B 16SOIC Технические характеристики: Интерфейс: I & sup2; C; Количество входов / выходов: 8; Частота – Часы: 100 кГц; Напряжение – Питание: 2.5 В ~ 6 В; Упаковка / ящик: 16-SOIC (0,295 дюйма, ширина 7,50 мм); упаковка: цифровая катушка; рабочая температура: от -40 ° C до 85 ° C; выход прерывания: да; статус бессвинца: бессвинцовый; статус RoHS:

BUK9612-55B, 118: Fet – Отдельный дискретный полупроводниковый прибор 75A 55V 157W поверхностный монтаж; MOSFET N-CH 55V 75A D2PAK Технические характеристики: Тип установки: поверхностный монтаж; Тип полевого транзистора: МОП-транзистор с N-каналом, оксид металла; Напряжение стока в источник (Vdss): 55 В; Ток – постоянный сток (Id) при 25 ° C: 75 А; Rds On (макс.) При Id, Vgs: 10 мОм при 25 А, 10 В; Входная емкость (Ciss) @ Vds: 3693 пФ @ 25 В; Мощность – Макс: 157 Вт; Упаковка: Cut

OM7607 / BGA2715: комплекты для оценки и разработки RF, плата RF / if и RFID; EVAL BOARD FOR BGA2715 Технические характеристики: Тип: Усилитель; В комплекте: доска; Для использования с / сопутствующими продуктами: BGA2715; Частота: 0 Гц ~ 4 ГГц; Статус без свинца: свинец не применяется; Статус RoHS: RoHS неприменимо

PDTC114YK, 115: Транзистор (bjt) – одиночный, дискретный полупроводниковый продукт с предварительным смещением, 100 мА, 50 В, 250 мВт, NPN – с предварительным смещением; TRANS NPN 50V 100MA SOT346 Технические характеристики: Тип транзистора: NPN – с предварительным смещением; Напряжение пробоя коллектор-эмиттер (макс.): 50 В; Ток коллектора (Ic) (макс.): 100 мА; Мощность – Макс: 250 мВт; Резистор – База (R1) (Ом): 10К; Резистор – база эмиттера (R2) (Ом): 47K; Насыщение Vce (макс.) При Ib, Ic: 100 мВ при 250 А, 5 мА; Curren

935027530602: СЕРИЯ ABT, ОКТАЛЬНЫЙ 1-БИТНЫЙ ПЕРЕДАТЧИК, ИСТИННЫЙ ВЫХОД, PDSO20 Технические характеристики: Технология: BICMOS; Тип устройства: трансивер; Напряжение питания: 5 В; Рабочая температура: от -40 до 85 C (от -40 до 185 F); Тип упаковки: 7.50 ММ, ПЛАСТИК, МС-013, СОТ-163-1, СО-20; Контакты: 20; Особенности: RoHS

Экспрессия EL1 и низкой молекулярной массы циклина E в груди …

Контекст 1

… и EL6 (M r 33000) генерируются расщеплением на D70. Изоформа EL4 (M r 40 000) генерируется с использованием альтернативного стартового кодона метионина 46. In vitro мы обнаружили, что введение этих LMW-форм в иммортализованные, неопухолевые эпителиальные клеточные линии молочной железы приводит к изменениям в контрольной точке G 1 -S ( 10, 11).Нарушение регуляции уровня циклина E может способствовать возникновению некоторых видов рака. Например, несколько исследований показали, что конститутивная или индуцибельная сверхэкспрессия циклина E приводит к уменьшению длины интервала G 1, ускоренному переходу в S-фазу и уменьшению размера клеток; он также снижает потребность в сыворотке крови для перехода из фазы G 1 -S (12, 13). Когда циклин E сверхэкспрессируется в фибробластах человека, этим клеткам требуется сыворотка для продолжительной пролиферации, они не образуют очагов в мягком агаре и не иммортализуются, что позволяет предположить, что избыточной экспрессии циклина E недостаточно для трансформации клеток (12).Когда циклин E сверхэкспрессируется в молочных железах трансгенных мышей через промотор ␤-лактоглобулина, у 12% животных развиваются карциномы груди, но только после длительного латентного периода в 8-13 месяцев (14), что позволяет предположить, что для этого необходимы дополнительные молекулярные события. развитие этих раковых образований. Кроме того, конститутивная сверхэкспрессия циклина E (но не циклина D1 или A) как в иммортализованных фибробластах эмбрионов крысы, так и в эпителиальных клетках молочной железы человека приводит к хромосомной нестабильности (15). Оборот циклина E, который контролируется сайт-специфическим фосфорилированием (16, 17) и F-бокс-белком Fbw7 (4), также не регулируется при раке.Fbw7, который также называют Cdc4, отвечает за деградацию циклина E человека и мутирует в клеточных линиях рака груди и яичников с высоким уровнем белка циклина E (18, 19) и по крайней мере в 16% опухолей эндометрия человека (20 ). Во всех этих исследованиях использовалась конструкция циклина E, в которой отсутствуют экзоны 1 и 2, так что трансляция начинается с метионина 16 в экзоне 3 и кодирует белок циклин E с M r 45000. Последующие исследования предоставили доказательства того, что полноразмерный циклин E, который в большом количестве встречается в опухолевых клетках, транслируется с мРНК циклина EL (т.е.е. удлиненный из 15 аминокислот вариант циклина E; Ref. 21), а не из формы M r 45000, изначально клонированной как этот циклин G 1 (22, 23). Более того, белок Mr 45000 не обнаруживается в эпителиальных клетках молочных желез, а форма циклина E, которая в большом количестве экспрессируется как в нормальных, так и в опухолевых клетках, представляет собой полноразмерный циклин EL1 с молекулярной массой Mr 50000 (5, 21 ). Остается вопрос, отличается ли биологическая роль полноразмерного циклина EL от опухолеспецифичных LMW форм.В LMW-формах циклина E отсутствуют различные количества NH 2 -конца нативной молекулы, которые образуются в результате протеолитического расщепления, опосредованного эластазой, протеазой, которая сама участвует в метастазировании рака молочной железы. Следовательно, эти низкомолекулярные формы циклина E могут быть просто суррогатным маркером плохого прогноза и не связаны напрямую с прогрессированием заболевания и метастазированием. В этом исследовании мы непосредственно рассмотрели биологическую роль низкомолекулярных форм циклина Е, используя модельную систему, сверхэкспрессирующую нативную полноразмерную или каждую из низкомолекулярных форм в эстроген-чувствительной, антиэстроген-чувствительной клеточной линии опухоли молочной железы MCF-7. .Мы показываем, что MCF-7 с избыточной экспрессией LMW-форм, а не полноразмерных форм, обладают более высокой киназной активностью, связанной с циклином E, и устойчивы к ингибированию p21 и p27 в клеточном контексте, где p53 и p21 значительно индуцируются. Эти сверхэкспрессирующие LMW клетки также устойчивы к ингибирующей рост активности антиэстрогенов, опосредованной резистентностью этих клеток к p21. Мы также показываем, что среди пациентов с ER-положительными опухолями, которые экспрессируют высокие уровни циклина E, уровень специфической выживаемости (DSS) не улучшается при лечении антиэстрогенами.Наконец, низкомолекулярные формы циклина E также вызывают хромосомные аномалии, и пациенты с высоким уровнем циклина E более склонны к полиплоидным опухолям, чем пациенты с низким уровнем циклина E. В совокупности данные, представленные в этом отчете, свидетельствуют о том, что обработка Полноразмерного циклина E в его LMW-формы может быть одним из ключевых ранних событий, ведущих к более агрессивному и летальному фенотипу рака груди. Clin E в клетках рака молочной железы. В качестве первого шага к пониманию биологических свойств низкомолекулярных форм циклина E при раке молочной железы мы создали модельную систему с использованием стабильно трансфицированных эпителиальных клеток молочной железы человека MCF-7.Родительские клетки происходят от аденокарциномы груди человека. Они являются ER-положительными, экспрессируют опухолеспецифические LMW-формы на низких уровнях (4) и являются моделью эстроген-чувствительных, антиэстроген-чувствительных опухолей молочной железы. Клетки MCF-7 трансфецировали либо одной основной цепью вектора (4.0), либо одной из трех конструкций циклина E, меченных FLAG, названных EL1, T1 или T2. Конструктивные коды EL1 для полноразмерной формы циклина E M r 50 000 (обозначены как EL1; рис. 1 A), конструктивные коды T1 для форм M r 45 000 и M r 44 000 (обозначенные как EL2 и EL3) и T2 построить коды для форм M r 35 000 и M r 33 000 (обозначенных EL5 и EL6).Следовательно, формы, генерируемые конструкциями T1 и T2, соответствуют эндогенным формам LMW, которые мы назвали EL2,3 и EL5,6 соответственно (5). EL2,3 (т.е. T1) и EL5,6 (т.е. T2) экспрессируются в ER-отрицательных клетках рака молочной железы, образованных после расщепления эластазоподобной протеазой по сайтам аминокислот 40-45 и A69-D70, соответственно ( 5). Отбирали несколько клонов, представляющих каждый из трансфицированных векторов, и их экспрессию циклина E оценивали с помощью вестерн-блоттинга с использованием антител против FLAG и против циклина E.Эти эксперименты выявили разные уровни экспрессии каждой из изоформ циклина E (рис. 1B), а уровень экспрессии циклина E в каждом клоне соответствовал его киназной активности: клоны T1 и T2 показали в 3-5 раз более высокий уровень FLAG- ассоциированная киназная активность и в 2 раза более высокая активность ассоциированной с циклином E киназы, чем у клонов EL1 (рис. 1С). Более того, сверхэкспрессия циклина E приводила к увеличению уровней экспрессии p53 (P <0,0039) и p21 (P <0,0446), тогда как p27 (P <0,3423) и Cdk2 (P <0.2584) уровни оставались относительно неизменными по сравнению с таковыми в пустых клетках, содержащих только вектор. Торможение. Затем мы исследовали биохимические взаимодействия LMW-форм циклина E с его партнером по киназе CDK2 и ингибиторами CDK2 (CKI) p21 и p27 в трех клонах, сверхэкспрессирующих циклин EL1 или одну из LMW-форм (рис. 2). Эти клоны были выбраны, так как они сверхэкспрессировали циклин E, T1 и T2 на аналогичных уровнях (т.е. в 4, 6 и 5 раз выше уровней, соответственно, чем эндогенный белок циклин E), и эта сверхэкспрессия совпадала с p53 активация и параллельная индукция p21.В клетках со сверхэкспрессией EL1 и p53, и p21 индуцировались в 2 раза по сравнению с родительским или только векторным контролем, тогда как в клонах T1 и T2 p53 и p21 индуцировались в 2,5 и 5 раз, соответственно, по сравнению с контролем. (Рис. 2 А). Несмотря на высокие уровни p21 в клетках, трансфицированных циклином E, T1- и T2-сверхэкспрессирующие клетки проявляли в 4-5 раз большую активность киназы, связанной с FLAG, чем форма EL1, и в 3 раза большую активность киназы, связанной с циклином E, и Активность киназы CDK2 по сравнению с пустыми клетками, содержащими только вектор (рис.2 Б). Следовательно, хотя уровни сверхэкспрессии циклина E между формами EL1 и LMW были сходными (рис. 2A; т.е. все в 5 раз выше, чем у эндогенного циклина E), клоны с избыточной экспрессией LMW имели более высокий уровень FLAG, циклина E и CDK2. киназной активности по сравнению с клонами EL1 (рис. 2B), даже в присутствии высоких уровней p21. Чтобы изучить механизм различий в активности киназ между формами EL1 и LMW, мы проанализировали состав иммунных комплексов циклина E в каждом из клонов (рис.2 С). Для этих экспериментов циклин E иммунопреципитировали с использованием поликлональных антител, как описано в другом месте (5, 7), с последующим вестерн-блоттингом с указанными моноклональными антителами (фиг. 2 C). Наши результаты показали, что 5-кратное увеличение уровня циклина E сопровождалось усилением связывания p21 и p27 с комплексами циклина E. В частности, комплексы EL1 содержали в 7 раз больше p21, чем контроли, тогда как комплексы T1 и T2 содержали в 15 раз больше p21, чем контроли.Точно так же степень связывания p27 с комплексами T1 и T2 была намного выше, чем с клетками EL1 или контролями (фиг. 2 C), несмотря на отсутствие увеличения базальных уровней p27 (фиг. 2 A). Это связывание p21 и p27 привело к снижению активности комплексов циклина EL1. В комплексах T1 и T2, однако, даже при высоких уровнях связывания p21 и p27, киназа циклин E была в 2 раза выше, чем активность киназы, ассоциированной с EL1, что позволяет предположить, что активности киназы циклина E, связанные с комплексами формы LMW, являются более устойчив к ингибированию p21 и p27, чем активность киназы циклина E, связанная с полноразмерным циклином E.Затем мы исследовали состав комплексов CDK2 в клонах циклина E и обнаружили, что в 4 раза больше p21 и p27 было связано с CDK2 в клонах T1 и T2, чем в клонах EL1 (рис. 2 D). Это повышенное связывание было частично связано с более высокими уровнями CDK2 в клонах T1 и T2, чем в клонах EL1 (фиг. 2 A). Мы также обнаружили большую активность киназы CDK2 в клонах T1 и T2, чем в клонах EL1, несмотря на повышенное связывание p21 и p27 с комплексами T1- и T2-Cdk2 (рис. 2, B и D). Эти результаты предполагают, что устойчивость низкомолекулярных форм циклина Е к ингибированию р21 и р27 возникает не из-за отсутствия взаимодействия между низкомолекулярными формами и этими ингибиторами.Поскольку уровни CDK2 были в 2 раза выше в клонах T1 и T2, чем в клонах EL1 (рис. 2A), более высокая киназная активность, связанная как с CDK2, так и с циклином E, в клонах T1 и T2 может отражать более высокий уровень CDK2. уровни и / или большее сродство T1 и ...

Контекст 2

… не образуют очагов в мягком агаре и не иммортализуются, что позволяет предположить, что избыточной экспрессии циклина E недостаточно для трансформации клеток (12 ). Когда циклин E сверхэкспрессируется в молочных железах трансгенных мышей через промотор ␤-лактоглобулина, у 12% животных развиваются карциномы груди, но только после длительного латентного периода в 8-13 месяцев (14), что позволяет предположить, что для этого необходимы дополнительные молекулярные события. развитие этих раковых образований.Кроме того, конститутивная сверхэкспрессия циклина E (но не циклина D1 или A) как в иммортализованных фибробластах эмбрионов крысы, так и в эпителиальных клетках молочной железы человека приводит к хромосомной нестабильности (15). Оборот циклина E, который контролируется сайт-специфическим фосфорилированием (16, 17) и F-бокс-белком Fbw7 (4), также не регулируется при раке. Fbw7, который также называют Cdc4, отвечает за деградацию циклина E человека и мутирует в клеточных линиях рака груди и яичников с высоким уровнем белка циклина E (18, 19) и по крайней мере в 16% опухолей эндометрия человека (20 ).Во всех этих исследованиях использовалась конструкция циклина E, в которой отсутствуют экзоны 1 и 2, так что трансляция начинается с метионина 16 в экзоне 3 и кодирует белок циклин E с M r 45000. Последующие исследования предоставили доказательства того, что полноразмерный циклин E, который в большом количестве встречается в опухолевых клетках, транслируется с мРНК циклина EL (т. Е. Удлиненного из 15 аминокислот варианта циклина E; ссылка 21), а не с формы M r 45000. первоначально клонировали как этот циклин G 1 (22, 23). Более того, белок Mr 45000 не обнаруживается в эпителиальных клетках молочных желез, а форма циклина E, которая в большом количестве экспрессируется как в нормальных, так и в опухолевых клетках, представляет собой полноразмерный циклин EL1 с молекулярной массой Mr 50000 (5, 21 ).Остается вопрос, отличается ли биологическая роль полноразмерного циклина EL от опухолеспецифичных LMW форм. В LMW-формах циклина E отсутствуют различные количества NH 2 -конца нативной молекулы, которые образуются в результате протеолитического расщепления, опосредованного эластазой, протеазой, которая сама участвует в метастазировании рака молочной железы. Следовательно, эти низкомолекулярные формы циклина E могут быть просто суррогатным маркером плохого прогноза и не связаны напрямую с прогрессированием заболевания и метастазированием.В этом исследовании мы непосредственно рассмотрели биологическую роль низкомолекулярных форм циклина Е, используя модельную систему, сверхэкспрессирующую нативную полноразмерную или каждую из низкомолекулярных форм в эстроген-чувствительной, антиэстроген-чувствительной клеточной линии опухоли молочной железы MCF-7. . Мы показываем, что MCF-7 с избыточной экспрессией LMW-форм, а не полноразмерных форм, обладают более высокой киназной активностью, связанной с циклином E, и устойчивы к ингибированию p21 и p27 в клеточном контексте, где p53 и p21 значительно индуцируются. Эти сверхэкспрессирующие LMW клетки также устойчивы к ингибирующей рост активности антиэстрогенов, опосредованной резистентностью этих клеток к p21.Мы также показываем, что среди пациентов с ER-положительными опухолями, которые экспрессируют высокие уровни циклина E, уровень специфической выживаемости (DSS) не улучшается при лечении антиэстрогенами. Наконец, низкомолекулярные формы циклина E также вызывают хромосомные аномалии, и пациенты с высоким уровнем циклина E более склонны к полиплоидным опухолям, чем пациенты с низким уровнем циклина E. В совокупности данные, представленные в этом отчете, свидетельствуют о том, что обработка Полноразмерного циклина E в его LMW-формы может быть одним из ключевых ранних событий, ведущих к более агрессивному и летальному фенотипу рака груди.Clin E в клетках рака молочной железы. В качестве первого шага к пониманию биологических свойств низкомолекулярных форм циклина E при раке молочной железы мы создали модельную систему с использованием стабильно трансфицированных эпителиальных клеток молочной железы человека MCF-7. Родительские клетки происходят от аденокарциномы груди человека. Они являются ER-положительными, экспрессируют опухолеспецифические LMW-формы на низких уровнях (4) и являются моделью эстроген-чувствительных, антиэстроген-чувствительных опухолей молочной железы. Клетки MCF-7 трансфицировали либо основной цепью вектора (4.0) отдельно или с одной из трех конструкций циклина E, меченных FLAG, обозначенных как EL1, T1 или T2. Конструктивные коды EL1 для полноразмерной формы циклина E M r 50 000 (обозначены как EL1; рис. 1 A), конструктивные коды T1 для форм M r 45 000 и M r 44 000 (обозначенные как EL2 и EL3) и T2 построить коды для форм M r 35 000 и M r 33 000 (обозначенных EL5 и EL6). Следовательно, формы, генерируемые конструкциями T1 и T2, соответствуют эндогенным формам LMW, которые мы назвали EL2,3 и EL5,6 соответственно (5). EL2,3 (т.е., T1) и EL5,6 (т.е.T2) экспрессируются в ER-отрицательных клетках рака молочной железы, образованных после расщепления эластазоподобной протеазой по сайтам аминокислот 40-45 и A69-D70, соответственно (5). Отбирали несколько клонов, представляющих каждый из трансфицированных векторов, и их экспрессию циклина E оценивали с помощью вестерн-блоттинга с использованием антител против FLAG и против циклина E. Эти эксперименты выявили различные уровни экспрессии каждой из изоформ циклина E (рис. 1 B), а уровень экспрессии циклина E в каждом клоне соответствовал его киназной активности: клоны T1 и T2 показали в 3-5 раз более высокий уровень FLAG- ассоциированная киназная активность и в 2 раза более высокая активность киназы, ассоциированной с циклином E, чем у клонов EL1 (рис.1 В). Более того, сверхэкспрессия циклина E приводила к увеличению уровней экспрессии p53 (P <0,0039) и p21 (P <0,0446), тогда как уровни p27 (P <0,3423) и Cdk2 (P <0,2584) оставались относительно неизменными по сравнению с уровнями в пустых. только векторные ячейки. Торможение. Затем мы исследовали биохимические взаимодействия LMW-форм циклина E с его партнером по киназе CDK2 и ингибиторами CDK2 (CKI) p21 и p27 в трех клонах, сверхэкспрессирующих циклин EL1 или одну из LMW-форм (рис. 2).Эти клоны были выбраны, так как они сверхэкспрессировали циклин E, T1 и T2 на аналогичных уровнях (т.е. в 4, 6 и 5 раз выше уровней, соответственно, чем эндогенный белок циклин E), и эта сверхэкспрессия совпадала с p53 активация и параллельная индукция p21. В клетках со сверхэкспрессией EL1 и p53, и p21 индуцировались в 2 раза по сравнению с родительским или только векторным контролем, тогда как в клонах T1 и T2 p53 и p21 индуцировались в 2,5 и 5 раз, соответственно, по сравнению с контролем. (Рис. 2 А).Несмотря на высокие уровни p21 в клетках, трансфицированных циклином E, T1- и T2-сверхэкспрессирующие клетки проявляли в 4-5 раз большую активность киназы, ассоциированной с FLAG, чем форма EL1, и в 3 раза большую активность киназы, связанной с циклином E, и Активность киназы CDK2 по сравнению с пустыми клетками, содержащими только вектор (рис. 2В). Следовательно, хотя уровни сверхэкспрессии циклина E между формами EL1 и LMW были сходными (рис. 2A; т.е. все в 5 раз выше, чем у эндогенного циклина E), клоны с избыточной экспрессией LMW имели более высокие уровни FLAG, циклина E и CDK2. киназной активности по сравнению с клонами EL1 (рис.2 B), даже в присутствии высоких уровней p21. Чтобы изучить механизм различий в активности киназ между формами EL1 и LMW, мы проанализировали состав иммунных комплексов циклина E в каждом из клонов (рис. 2 C). Для этих экспериментов циклин E иммунопреципитировали с использованием поликлональных антител, как описано в другом месте (5, 7), с последующим вестерн-блоттингом с указанными моноклональными антителами (фиг. 2 C). Наши результаты показали, что 5-кратное увеличение уровня циклина E сопровождалось усилением связывания p21 и p27 с комплексами циклина E.В частности, комплексы EL1 содержали в 7 раз больше p21, чем контроли, тогда как комплексы T1 и T2 содержали в 15 раз больше p21, чем контроли. Точно так же степень связывания p27 с комплексами T1 и T2 была намного выше, чем с клетками EL1 или контролями (фиг. 2 C), несмотря на отсутствие увеличения базальных уровней p27 (фиг. 2 A). Это связывание p21 и p27 привело к снижению активности комплексов циклина EL1. В комплексах T1 и T2, однако, даже при высоких уровнях связывания p21 и p27, киназа циклин E была в 2 раза выше, чем активность киназы, ассоциированной с EL1, что позволяет предположить, что активности киназы циклина E, связанные с комплексами формы LMW, являются более устойчив к ингибированию p21 и p27, чем активность киназы циклина E, связанная с полноразмерным циклином E.Затем мы исследовали состав комплексов CDK2 в клонах циклина E и обнаружили, что в 4 раза больше p21 и p27 было связано с CDK2 в клонах T1 и T2, чем в клонах EL1 (рис. 2 D). Это повышенное связывание было частично связано с более высокими уровнями CDK2 в клонах T1 и T2, чем в клонах EL1 (фиг. 2 A). Мы также обнаружили большую активность киназы CDK2 в клонах T1 и T2, чем в клонах EL1, несмотря на повышенное связывание p21 и p27 с комплексами T1- и T2-Cdk2 (рис. 2, B и D). Эти результаты предполагают, что устойчивость низкомолекулярных форм циклина Е к ингибированию р21 и р27 возникает не из-за отсутствия взаимодействия между низкомолекулярными формами и этими ингибиторами.Поскольку уровни CDK2 были в 2 раза выше в клонах T1 и T2, чем в клонах EL1 (рис. 2A), более высокая киназная активность, связанная как с CDK2, так и с циклином E, в клонах T1 и T2 могла отражать более высокий уровень CDK2. уровни и / или большее сродство T1 и T2, чем EL1, к CDK2 (рис. 2, C и D). Следовательно, повышенная активность киназы циклин E в LMW-сверхэкспрессирующих клетках может быть частично связана с повышенным сродством T1 и T2 к Cdk2 и частично с их пониженной чувствительностью к ингибированию p21 и p27.Чтобы ответить на этот вопрос, мы исследовали киназную активность, связанную с p21 и p27, а также иммунные комплексы, связанные с каждым CKI (рис. 2, E и F). Для этого анализа CKI были иммунопреципитированы поликлональными антителами к p21 или p27, а затем подверглись как киназным анализам, так и Вестерн-блоттингу с указанными антителами (рис. 2, E – H). Результаты показывают, что активности как p21-, так и p27-связанных киназ были значительно выше в клонах T1 и T2, чем в клонах EL1.В частности, активность киназы ...

Контекст 3

… промотор, у 12% животных развивается карцинома молочной железы, но только после длительного периода ожидания в 8-13 месяцев (14), что позволяет предположить, что возникают дополнительные молекулярные события необходим для развития этих видов рака. Кроме того, конститутивная сверхэкспрессия циклина E (но не циклина D1 или A) как в иммортализованных фибробластах эмбрионов крысы, так и в эпителиальных клетках молочной железы человека приводит к хромосомной нестабильности (15). Оборот циклина E, который контролируется сайт-специфическим фосфорилированием (16, 17) и F-бокс-белком Fbw7 (4), также не регулируется при раке.Fbw7, который также называют Cdc4, отвечает за деградацию циклина E человека и мутирует в клеточных линиях рака груди и яичников с высоким уровнем белка циклина E (18, 19) и по крайней мере в 16% опухолей эндометрия человека (20 ). Во всех этих исследованиях использовалась конструкция циклина E, в которой отсутствуют экзоны 1 и 2, так что трансляция начинается с метионина 16 в экзоне 3 и кодирует белок циклин E с M r 45000. Последующие исследования предоставили доказательства того, что полноразмерный циклин E, который в большом количестве встречается в опухолевых клетках, транслируется с мРНК циклина EL (т.е.е. удлиненный из 15 аминокислот вариант циклина E; Ref. 21), а не из формы M r 45000, изначально клонированной как этот циклин G 1 (22, 23). Более того, белок Mr 45000 не обнаруживается в эпителиальных клетках молочных желез, а форма циклина E, которая в большом количестве экспрессируется как в нормальных, так и в опухолевых клетках, представляет собой полноразмерный циклин EL1 с молекулярной массой Mr 50000 (5, 21 ). Остается вопрос, отличается ли биологическая роль полноразмерного циклина EL от опухолеспецифичных LMW форм.В LMW-формах циклина E отсутствуют различные количества NH 2 -конца нативной молекулы, которые образуются в результате протеолитического расщепления, опосредованного эластазой, протеазой, которая сама участвует в метастазировании рака молочной железы. Следовательно, эти низкомолекулярные формы циклина E могут быть просто суррогатным маркером плохого прогноза и не связаны напрямую с прогрессированием заболевания и метастазированием. В этом исследовании мы непосредственно рассмотрели биологическую роль низкомолекулярных форм циклина Е, используя модельную систему, сверхэкспрессирующую нативную полноразмерную или каждую из низкомолекулярных форм в эстроген-чувствительной, антиэстроген-чувствительной клеточной линии опухоли молочной железы MCF-7. .Мы показываем, что MCF-7 с избыточной экспрессией LMW-форм, а не полноразмерных форм, обладают более высокой киназной активностью, связанной с циклином E, и устойчивы к ингибированию p21 и p27 в клеточном контексте, где p53 и p21 значительно индуцируются. Эти сверхэкспрессирующие LMW клетки также устойчивы к ингибирующей рост активности антиэстрогенов, опосредованной резистентностью этих клеток к p21. Мы также показываем, что среди пациентов с ER-положительными опухолями, которые экспрессируют высокие уровни циклина E, уровень специфической выживаемости (DSS) не улучшается при лечении антиэстрогенами.Наконец, низкомолекулярные формы циклина E также вызывают хромосомные аномалии, и пациенты с высоким уровнем циклина E более склонны к полиплоидным опухолям, чем пациенты с низким уровнем циклина E. В совокупности данные, представленные в этом отчете, свидетельствуют о том, что обработка Полноразмерного циклина E в его LMW-формы может быть одним из ключевых ранних событий, ведущих к более агрессивному и летальному фенотипу рака груди. Clin E в клетках рака молочной железы. В качестве первого шага к пониманию биологических свойств низкомолекулярных форм циклина E при раке молочной железы мы создали модельную систему с использованием стабильно трансфицированных эпителиальных клеток молочной железы человека MCF-7.Родительские клетки происходят от аденокарциномы груди человека. Они являются ER-положительными, экспрессируют опухолеспецифические LMW-формы на низких уровнях (4) и являются моделью эстроген-чувствительных, антиэстроген-чувствительных опухолей молочной железы. Клетки MCF-7 трансфецировали либо одной основной цепью вектора (4.0), либо одной из трех конструкций циклина E, меченных FLAG, названных EL1, T1 или T2. Конструктивные коды EL1 для полноразмерной формы циклина E M r 50 000 (обозначены как EL1; рис. 1 A), конструктивные коды T1 для форм M r 45 000 и M r 44 000 (обозначенные как EL2 и EL3) и T2 построить коды для форм M r 35 000 и M r 33 000 (обозначенных EL5 и EL6).Следовательно, формы, генерируемые конструкциями T1 и T2, соответствуют эндогенным формам LMW, которые мы назвали EL2,3 и EL5,6 соответственно (5). EL2,3 (т.е. T1) и EL5,6 (т.е. T2) экспрессируются в ER-отрицательных клетках рака молочной железы, образованных после расщепления эластазоподобной протеазой по сайтам аминокислот 40-45 и A69-D70, соответственно ( 5). Отбирали несколько клонов, представляющих каждый из трансфицированных векторов, и их экспрессию циклина E оценивали с помощью вестерн-блоттинга с использованием антител против FLAG и против циклина E.Эти эксперименты выявили разные уровни экспрессии каждой из изоформ циклина E (рис. 1B), а уровень экспрессии циклина E в каждом клоне соответствовал его киназной активности: клоны T1 и T2 показали в 3-5 раз более высокий уровень FLAG- ассоциированная киназная активность и в 2 раза более высокая активность ассоциированной с циклином E киназы, чем у клонов EL1 (рис. 1С). Более того, сверхэкспрессия циклина E приводила к увеличению уровней экспрессии p53 (P <0,0039) и p21 (P <0,0446), тогда как p27 (P <0,3423) и Cdk2 (P <0.2584) уровни оставались относительно неизменными по сравнению с таковыми в пустых клетках, содержащих только вектор. Торможение. Затем мы исследовали биохимические взаимодействия LMW-форм циклина E с его партнером по киназе CDK2 и ингибиторами CDK2 (CKI) p21 и p27 в трех клонах, сверхэкспрессирующих циклин EL1 или одну из LMW-форм (рис. 2). Эти клоны были выбраны, так как они сверхэкспрессировали циклин E, T1 и T2 на аналогичных уровнях (т.е. в 4, 6 и 5 раз выше уровней, соответственно, чем эндогенный белок циклин E), и эта сверхэкспрессия совпадала с p53 активация и параллельная индукция p21.В клетках со сверхэкспрессией EL1 и p53, и p21 индуцировались в 2 раза по сравнению с родительским или только векторным контролем, тогда как в клонах T1 и T2 p53 и p21 индуцировались в 2,5 и 5 раз, соответственно, по сравнению с контролем. (Рис. 2 А). Несмотря на высокие уровни p21 в клетках, трансфицированных циклином E, T1- и T2-сверхэкспрессирующие клетки проявляли в 4-5 раз большую активность киназы, связанной с FLAG, чем форма EL1, и в 3 раза большую активность киназы, связанной с циклином E, и Активность киназы CDK2 по сравнению с пустыми клетками, содержащими только вектор (рис.2 Б). Следовательно, хотя уровни сверхэкспрессии циклина E между формами EL1 и LMW были сходными (рис. 2A; т.е. все в 5 раз выше, чем у эндогенного циклина E), клоны с избыточной экспрессией LMW имели более высокий уровень FLAG, циклина E и CDK2. киназной активности по сравнению с клонами EL1 (рис. 2B), даже в присутствии высоких уровней p21. Чтобы изучить механизм различий в активности киназ между формами EL1 и LMW, мы проанализировали состав иммунных комплексов циклина E в каждом из клонов (рис.2 С). Для этих экспериментов циклин E иммунопреципитировали с использованием поликлональных антител, как описано в другом месте (5, 7), с последующим вестерн-блоттингом с указанными моноклональными антителами (фиг. 2 C). Наши результаты показали, что 5-кратное увеличение уровня циклина E сопровождалось усилением связывания p21 и p27 с комплексами циклина E. В частности, комплексы EL1 содержали в 7 раз больше p21, чем контроли, тогда как комплексы T1 и T2 содержали в 15 раз больше p21, чем контроли.Точно так же степень связывания p27 с комплексами T1 и T2 была намного выше, чем с клетками EL1 или контролями (фиг. 2 C), несмотря на отсутствие увеличения базальных уровней p27 (фиг. 2 A). Это связывание p21 и p27 привело к снижению активности комплексов циклина EL1. В комплексах T1 и T2, однако, даже при высоких уровнях связывания p21 и p27, киназа циклин E была в 2 раза выше, чем активность киназы, ассоциированной с EL1, что позволяет предположить, что активности киназы циклина E, связанные с комплексами формы LMW, являются более устойчив к ингибированию p21 и p27, чем активность киназы циклина E, связанная с полноразмерным циклином E.Затем мы исследовали состав комплексов CDK2 в клонах циклина E и обнаружили, что в 4 раза больше p21 и p27 было связано с CDK2 в клонах T1 и T2, чем в клонах EL1 (рис. 2 D). Это повышенное связывание было частично связано с более высокими уровнями CDK2 в клонах T1 и T2, чем в клонах EL1 (фиг. 2 A). Мы также обнаружили большую активность киназы CDK2 в клонах T1 и T2, чем в клонах EL1, несмотря на повышенное связывание p21 и p27 с комплексами T1- и T2-Cdk2 (рис. 2, B и D). Эти результаты предполагают, что устойчивость низкомолекулярных форм циклина Е к ингибированию р21 и р27 возникает не из-за отсутствия взаимодействия между низкомолекулярными формами и этими ингибиторами.Поскольку уровни CDK2 были в 2 раза выше в клонах T1 и T2, чем в клонах EL1 (рис. 2A), более высокая киназная активность, связанная как с CDK2, так и с циклином E, в клонах T1 и T2 могла отражать более высокий уровень CDK2. уровни и / или большее сродство T1 и T2, чем EL1, к CDK2 (рис. 2, C и D). Следовательно, повышенная активность киназы циклин E в LMW-сверхэкспрессирующих клетках может быть частично связана с повышенным сродством T1 и T2 к Cdk2 и частично с их пониженной чувствительностью к ингибированию p21 и p27.